胆微透析技术及其在药学研究中的应用

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1、胆微透析技术及其在药学研究中的应用胆微透析技术及其在药学研究中的应用　　胆微透析技术能直接、有效地对胆汁中的药物及其代谢产物浓度进行持续检测，是药物动力学研究的重要工具，具有不可替代的作用及广阔的应用前景。本文就胆微透析技术的基本原理、特点及影响因素作一综述，并重点介绍其在具有肠肝循环或经胆囊排泄药物的药物动力学研究中的应用。　　1胆微透析技术的原理和特点　　胆微透析技术以透析原理作为取样基础，透析探针为半密闭系统，由大小两个导管组成，各有一入口和出口。用于引流胆汁的大导管可植入一只成年大鼠的胆管中，小导管即

2、灌流液导管则由一根悬挂在大导管中的线性探针构成。通过灌流泵以一定流速推动灌流液由入口进入探针中，胆汁中的低分子量物质随浓度梯度经透析膜连续不断进入灌流液导管内，从而达到从活体组织中取样的目的[1-6]。通过胆微透析收集得到的透析液可直接用于检测分析而不影响机体胆汁流量和无胆汁丢失。胆微透析也可较长时间用于清醒的、自由活动的动物[7]。胆微透析探针的示意图见图1。　　透析膜对于分子大小有一定限制，唯有较小分子量的物质才能通过半透膜，因此，胆微透析采样所得到的样品为非蛋白结合态的小分子物质，结合态的物质则因分子过

3、大无法通过半透膜，而不能被收集检测[1-2]。肝脏分泌进入胆汁的化合物通常为分子量超过300～400g/mol的极性分子，而实际分子量的界限取决于物种，大鼠是325g/mol，人体是500g/mol。分子在肝脏经过生物转化形成的代谢产物可增加母体化合物的分子量和极性，形成的轭合物更容易被检测到。　　胆瘘引流术是目前动态连续研究胆汁中物质的最常用的取胆汁样本的方法。与这种传统方法相比，胆微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体、实时和在线取样,特别适用于研究生命过程的动态变化。另一

4、大优点是样品的采集与分析过程既可离线也可在线检测，它与HPLC及CE等微量及超微量分离.L.、分析技术相结合,具有非常高的检测灵敏度和选择性[8-11]。　　2胆微透析技术的影响因素　　2.1胆汁组分　　了解胆汁成分是如何影响透析液丢失和药物跨透析膜转运是非常重要的。灌流液经膜丢失可能会大大减少所收集的透析液量。在线研究时，液体流速的变化可能引起进样量的变化，从而影响透析物的定量以及探针回收率的校正。在灌流液中加入胶体右旋糖酐-70可平衡在这些组织中的液体在探针膜两侧间的流动[12]。　　2.2超滤和渗透差　

5、　在透析过程中，超滤和渗透流量都能引起灌流液的流失。超滤是因压力差而发生的液体的跨膜流动。膜两侧的非扩散性颗粒浓度的差异引起的水分的跨膜转运即为渗透流量。以Ringers液作为灌流液用于大鼠胆微透析，就会发生渗透流量致使水分流向探针膜外，引起所收集的透析液量大为减少。而在Ringers液中加入浓度约为2%的胆盐，则足以阻止水分的丢失，维持正常流速。　　2.3灌流液组分　　探针中灌流液组分可明显影响胆透析液的收集量。由于小分子离子能够自由穿过透析膜，迅速形成膜两侧离子浓度的平衡，因此，以去离子水作为灌流液透析1

6、M氯化钠溶液或林格氏液时，透析液量无显著改变。但是当胆汁引流管中是浓度为10mM的十二烷基硫酸钠或者胆盐林格氏液时，收集到的样品量就有显著减少。　　胆盐和十二烷基硫酸钠是疏水性大分子物质，两者均不易通过透析膜，但如果仅以分子量而言，有少数的胆盐和十二烷基硫酸钠分子还是可以通过膜进入透析管从而降低膜两侧的渗透压差。在大鼠的胆汁中，胆汁酸普遍以混合微胶粒的大聚合物形式存在，临界胶粒浓度的范围是5～15mM，混合微胶粒大约包含500个胆汁酸分子，分子量27000道尔顿左右[13]。与胆汁酸分子相比较，微胶粒的形成会

7、降低胆汁的总渗透压，但是由于这些大聚集物完全无法透过探针膜，其产生的渗透压差就会驱动水从探针膜内流出。尤其当胆盐的浓度超过临界胶粒浓度时，收集到的透析液量急剧下降。　　2.4流速及维护　　流速的测量均在室温下进行，一般灌流速度在1～20μL/min左右。　　收集液前要求探针先透析平衡30min。每次透析实验后用去离子水冲洗探针，同时检测探针的完整性。在无探针的导管中，以1μL/min的速度灌流60min以检测推助器的流速。　　3胆微透析探针回收率的测定方法　　由于胆微透析采样主要是利用探针上透析膜

8、的扩散作用进行药物的采样，所得到的是部分未结合型药物并非探针外组织外液的药物总浓度，因此必须测定微透析探针采样的体外回收率，用以计算组织外液的实际药物浓度。　　胆汁微透析探针回收率的测定方法为：针筒内装含有药物的林格氏液，此部分药物浓度称为Cs,利用灌流泵设定流速为20或40μL/min模拟胆汁流入探针的状态，然后胆汁探针的部分利用林格氏液做灌流液。利用微透析注射针帮助灌流液以流速2.6&mu