tat融合蛋白转导红内期恶性疟原虫论文

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1、TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫论文王宪锋，刘忠湘，李淑梅，缪军【关键词】恶性疟原虫IntracellulardeliveryofTATfusionproteinintoerythrocytestagePlasmodiumfalciparum【Abstract】AIM:ToinvestigatethetransductionofTATp53fusionproteinintoerythrocytestagePlasmodiumfalciparum(P.f).METHODS:PurifiedTATp53prote

2、inandp53proteinalarialparasiteculturefor30min.Thebloodsmearmunofluorescenceassayaftertransduction.TheeffectofTATp53onthegroinedbycountingtheparasitemiachangesbetiaofP.fculturetreatedalarialparasite.【Keyodiumfalciparum;TATp53;proteintransduction【摘要】目的：探讨TATp5

3、3融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性.方法：将纯化的TATp53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30min后，制备血涂片，利用间接免疫荧光方法检测融合蛋白的转导.同时计算融合蛋白与疟原虫共孵育12h前后的感染率变化，观察蛋白转导对疟原虫生长的影响.结果：TATp53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜，进入虫体细胞内.freelanimmunodeficiencyvirustype1,HIV1)TAT(transactivatortranscription)蛋白的蛋白功能区，即蛋白转导结构域（p

4、roteintransductiondomain，PTD）［5］，能够有效的引导肽段或者蛋白质进入细胞，具有蛋白传送功能.我们即将TATp53融合蛋白与红内期恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum，P.f)进行共孵育，观察融合蛋白是否能通过疟原虫的多层细胞膜转导入虫体，以期为疟原虫基因功能的研究引入一种新的技术手段.1材料和方法1.1材料恶性疟原虫D10株由德国海德堡大学Dr.MichaelLanzer赠送，参照刘忠湘等［6］的方法进行培养.O+红细胞来自本实验室志愿者，离心去除白细胞后用于疟原虫

5、培养.纯化的TATp53融合蛋白，p53蛋白，抗p53小鼠血清和抗AMAMSP小鼠血清为本实验室制备.PBS(10×储存液,Na2HPO412H2O40g,KH2PO45g,NaCl81g,200g/LNaN31mL,pH7.2)，羊抗鼠免疫球蛋白为美国Sigma产品.1.2方法1.2.1蛋白转导未经同步化的恶性疟原虫培养物用于转导试验.96孔板中每孔接种200μL培养原虫，然后加入纯化的TATp5315μL或p53蛋白，轻缓混匀后置于37℃细胞培养箱中继续培养30min.将蛋白虫体混合物完全转移至1.5mL离

6、心管中，加入PBS于6000r/min离心7s,弃上清，用沉积的虫体细胞涂制原虫亚厚血涂片用于间接免疫荧光分析.1.2.2间接免疫荧光分析涂制的疟原虫血涂片浸入预冷的丙酮溶液中固定5min，空气自然干燥.为限定反应范围，每张涂片中用蜡笔画3个圆圈，每个圆圈中加入200μL用5g/LBSAPBS稀释(1∶100)的抗p53或AMAMSP小鼠血清，放入湿盒中作用30min后再浸入PBS于微型振荡器上振动洗涤3×5min.然后于每个圆圈中加入200μL以FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白（PBS1∶76稀释），于室温作用

7、30min，同上振动洗涤3×5min.滴加500mg/L甘油封片后荧光显微镜下观察.1.2.3蛋白转导对疟原虫的影响实验中将同一份培养原虫分为3组，即对照组，TATp53处理组和ACD/MCM处理组，每组重复3次.对照组不经任何处理；TATp53组：疟原虫与TATp53融合蛋白轻缓混匀后继续孵育12h；ACD/MCM组：参照文献［6］用枸橼酸葡萄糖抗凝剂（acidcitratedextrose，ACD）与疟原虫完全培养基(pletemalariaculturemedium，MCM)1∶1混合液处理疟原虫.作用后

8、计算疟原虫感染率［6］.统计学处理：方差分析和作图均利用GraphPadPrismv4.00forolBiochemParasitol,1997;90(1):131-144.［3］MeissnerM,KrejangE,GilsonPR,etal.TetracyclineanalogueregulatedtransgeneexpressioninPlasmodiumfalciparumb