恶性疟原虫msp1论文

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1、恶性疟原虫MSP1论文张忠广，常志尚，赵恒梅，宫玉香【关键词】疟原虫［摘要］目的构建恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量1.9万片段（MSP119）毕氏酵母真核表达克隆。方法利用PCR技术扩增出MSP119，插入pPIC9载体中，鉴定正确的MSP119基因，插入毕氏酵母分泌型表达载体pPIC9k中，DNA测序鉴定序列的正确性.freelplifiedbyPCRtechniquefromrebinantvectorpPIC9/PFCP2andinsertedintocloningvectorpPIC

2、9.RebinantexpressionvectorsedbyautomaticDNAsequencing.Byusingelectroporationtransformation,rebinantexpressionvectorscontainingMSP119genesedintopichiaGSll5cells.ResultsThepositiveclonesolecularbiologyisthebasisofMSP119expressioninpichiapastoris.［KEYSP119;gen

3、eamplification;plasmodiumfalciparum;eukaryoticexpression;pichiapastoris;polymerasechainreaction随着分子生物学技术的发展，基因工程疫苗的研制已成为当今世界性热点课题。毕氏酵母表达系统既具有原核表达系统能高效表达外源蛋白的特点，又具有真核生物的翻译后加工功能，使表达的外源蛋白具有生物学活性［1］，所以构建酵母表达克隆意义重大。本文选择恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白1C末端相对分子质量19×103片段（MSP119）的编码

4、序列为目的基因，与酵母表达载体pPIC9k进行重组构建，经酶切鉴定后获得MSP119的真核表达克隆。现报告如下。1材料与方法1．1材料及来源大肠杆菌(Escherichiac01)DH5a，毕氏酵母(PichiaPastoris)GSll5组氨酸缺陷型表达菌株，pPIC9(8023bp,ColElori,AmpR)、pPIC9k(9276bp,ColElori,AmpRkanR)，均购自美国Invitrogen公司。质粒pBluescriptks+(2960bp，ColElori，Amp+)为实验室保存；pB

5、KS／PFCP质粒为实验室保存。限制性内切酶购自BioLabs；T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶购自MBI公司；DNAMarker购自Promega公司。1．2引物设计与合成为便于目的蛋白纯化，在下游引物5′端加6个His基因，设计引物如下：上游引物P1：5′CCGCTCGAGAAAAGATTACAAATTTCTCAACATC3′；下游引物P2，5′CGGAATTCCTATTAATGATGATGATGATGATGATTAGAGGAAGAGCAGAAG3′。1．3MSP119片段的扩增及回收取pBKS／PF

6、CP2质粒模板DNA(0．5g／L)1μL在50μL反应体系中扩增，PCR混和液的组成：引物P1、P2各1μL，4种dNTP混合物(每种10mmol／L)1μL，10×Buffer缓冲液5μL，TaqDNA聚合酶1U，灭菌双蒸水补至50μL。充分混匀后，置PCR扩增仪中扩增，条件如下：94℃预变性5min；然后94℃30s、55℃30s、72℃1min，1期张忠广，常志尚，赵恒梅，等恶性疟原虫MSP119毕氏酵母真核表达克隆的构建51共28个循环；最后再72℃延伸10min。取PCR扩增产物5μL进行琼脂糖凝

7、胶电泳鉴定。按照华顺公司DNA回收试剂盒说明书进行操作，自凝胶中回收MSP119片段。1．4pPIC9／MSP119重组质粒的构建1．4．1目的基因及载体的酶切MSP119片段与pPIC9载体同时用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ进行酶切，酶切反应在50μL反应体系中进行，并选用两种酶的切割效率都较高的缓冲液，50μL反应体系包括：DNA20μL(含2μgDNA)，EcoRⅠ1μL(10×106U／L)，XhoⅠ1μL(10×106U／L)，100×BSA0．5μL，10×Buffer2．5μL，ddH2O2

8、2.5μL。37℃酶切1．5～2．0h，然后用热灭活法或加入琼脂糖上样缓冲液终止酶切反应，并按照华顺公司DNA回收试剂盒操作说明进行酶切片段的回收。1．4．2目的基因与载体的连接连接反应体系中外源DNA片段与载体DNA的摩尔数之比尽可能控制在4∶1，反应总体积为20μL，T4DNA连接酶的用量为1U，16℃连接过夜。1．4．3pPIC9／MSP119重组质粒的转化使用常规氯化钙法制备感受态受体菌，取