穿心莲内酯衍生物的急性毒性实验

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1、穿心莲内酯衍生物的急性毒性实验作者：张越华，曾和平，陈东风【摘要】　　目的运用生物活性指纹图谱预测其它中药能否促进骨髓间充质干细胞（bonemarroesenchymalstemcells,bMMSCs）。方法龟版浸膏依次用石油醚、乙醚、二氯甲烷提取，得到溶剂提取物，用MTT比色法及流式细胞仪器研究了溶剂提取物干细胞活性，采用GC-MS技术研究每一个提取物，根据总离子流色谱图的相同保留时间和相应峰面积，获得龟版浸膏GC-MS生物活性指纹图谱。结果初步结果表明溶剂提取物均能促进鼠bMMSCs的体外增殖，用龟版浸膏GC-MS生物活性指纹图谱来预测中药“四物汤

2、”的干细胞活性，预测准确率达83.3%。结论用这种方法来预测未知中药样品的干细胞活性，有一定的可靠性。【关键词】龟版；干细胞；增殖；气相色谱-质谱联用分析；指纹图谱　　Abstract：ObjectiveTopredictthepromotingeffectofChinesemedicineonproliferationofratbonemarroesenchymalstemcells(bMMSCs)bybioactivityfingerprintinvitro.MethodsTheointmentofplastrumtestudinisether,et

3、heranddichloromethaneinburntogaintheextracts.TheeffectsontheproliferationofbMMSCsinedbyMTTassayandfloetryanalysis,andeachsampleatogramofthesameretentiontimeandthecorrespondingpeakarea,theGC-MSfingerprintofbioactivityotetheproliferationofstemcells.Thefingerprintofbioactivityethodi

4、sreliabletopredictunknoedicinesamplesofstemcellactivity.　　Keytestudinis；Stemcell；Proliferation；GC-MS；Fingerprint　　龟版始载于《神农本草经》，列为中品。正品龟版是动物乌龟的干燥腹甲，龟版性微寒，味微咸，气微腥，含胶质、钙盐、脂肪和角蛋白等，具有补心肾，滋阴降火，潜阳退虚热等功效［1］。近年来，将龟版提取后，找到了促进干细胞增殖的龟版有效部位（简称龟版浸膏）。龟版浸膏能促进鼠bMMSCs的体外增殖［2］，促进大鼠骨髓损伤后及局灶性脑缺血后神经干细

5、胞增殖［3～5］，增强bMMSCs移殖后分化为神经元［6］；也可以在体外诱导成年大鼠bMMSCs分化为神经元样细胞［7］，经过较长时间诱导后bMMSCs还可能向成骨方向分化［8］。这提示龟版一方面可以促进MSCs增殖，另一方面可能启动MSCs向神经方向和成骨方向分化。　　龟版的化学成分很复杂，通过对龟版的乙醇浸出物和水的浸出物进行游离氨基酸和水解后氨基酸及微量元素等化学成分分析，发现龟版含17种氨基酸及锌、铁等人体必需微量元素［9］；孙苏亚等［10］研究了从黄喉拟水龟龟版中分离出的3种甾类化合物：胆甾醇、十二烯酸胆甾醇酯和甾醇-4-烯-3-酮；他们还用G

6、C-MS法研究了龟版中的脂肪酸类化合物［11］；姜大成等［12］从龟甲滋阴活性方面入手，用柱色谱和气相色谱分离并鉴定出具有滋阴活性的成分是十六烷酸胆甾醇酯和胆甾醇。　　龟版中什么化学组分起到调控干细胞增殖与分化成为我们感兴趣的问题。本课题组的研究初步确定龟版浸膏促进干细胞增殖不是单个分子的作用，而是多个分子协同作用的结果。于是我们考虑研究龟版浸膏GC-MS生物活性指纹图谱。　　用MTT比色法和流式细胞仪检测了溶剂提取物的干细胞活性，结果表明3个溶剂提取物均能促进鼠bMMSCs的体外增殖。采用GC-MS技术研究每一个提取物，根据总离子流色谱图，得到促进bM

7、MSCs增殖的龟版浸膏溶剂提取物GC-MS指纹图谱（简称为提取物指纹图谱），目的在于运用生物活性指纹图谱预测其它中药能否促进bMMSCs增殖。　　1器材与方法　　1.1仪器和试剂　　TraceDSQ型气相色谱-质谱联用仪（美国FinniganINC公司生产），EPICSXL-MCL型流式细胞分析仪（美国COULTER公司生产），所有试剂均为分析纯，龟版浸膏由广东中医药大学提供。　　1.2溶剂提取物样品的制备称取龟版浸膏2g，分别用250ml石油醚、乙醚、二氯甲烷加热回流24h后，分出各溶剂提取物，自然挥干后，得到溶剂提取物样品，分别记为石油醚提取物（Z-

8、1）、乙醚提取物（Z-2）、二氯甲烷提取物（Z-3）；各称取30mg溶剂提取物样