穿心莲内酯对hl

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1、穿心莲内酯对HL石静梁勇刚山西医科大学汾阳学院解剖研究室，山西汾阳032200【摘要】目的：研究穿心莲内酯诱导人HL-60细胞凋亡及相关机制。方法：以人早幼粒白血病细胞株HL-60为模型，作用于HL-60细胞的穿心莲内酯设3.125、6.25、12.5μg/ml三个受试浓度，实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四个组。采用AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对细胞色素C（CytC）蛋白表达的影响

2、。结果：穿心莲内酯能促进HL-60细胞凋亡，且呈剂量依赖性。穿心莲内酯作用HL-60细胞24h，CytC蛋白表达增加，12.5μg/ml作用浓度与溶媒对照相比有统计学意义（P＜0.05）。结论：穿心莲内酯能诱导HL-60细胞凋亡，其诱导凋亡机制可能与CytC释放的增加、线粒体通路有关。.jyqkl3个受试浓度。用DMSO溶解穿心莲内酯为50mg/ml贮存液，所需浓度在实验前用RPMI1640培养基稀释生成。实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml四个组

3、。1.3流式细胞仪检测穿心莲内酯作用HL-60细胞24h凋亡率把对数生长期的HL-60细胞浓度调整为1×106个/ml，以1ml/孔接种于6孔板内，加入不同浓度的穿心莲内酯，作用24h后离心收集细胞，PBS液洗涤细胞两次，按照AnnexinV/PI双染法（试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司）步骤操作，1h内上流式细胞仪进行检测，实验结果用DIversion2.9软件进行分析。1.4荧光标记/流式细胞术检测Cytc蛋白的表达细胞的培养、接种、加样品同上。穿心莲内酯作用HL-6024h后收集细胞，800

4、rpm离心5min后，用250μlPBS液清洗2次后重悬细胞于流式管中，加入20μl荧光标记的Cytc（购自Abzoom公司），上流式细胞仪进行检测。2统计学处理采用SPSS11.5统计软件进行数据的统计分析，用x±SD表示所有实验数据，P<0.05为差异具有统计学意义。3结果3.1穿心莲内酯作用HL-60细胞24h凋亡定量检测结果显示，和溶媒对照相比，穿心莲内酯各浓度作用于HL-6024h后，各组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率均随着穿心莲内酯浓度的升高逐渐升高，量效关系明显；与溶媒对照相

5、比，中、高浓度早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。3.2穿心莲内酯作用HL-60细胞24hCytC蛋白表达变化结果表明，与溶媒对照相比，不同浓度的穿心莲内酯作用HL-60细胞24h后，CytC蛋白表达逐渐增加，表明穿心莲内酯作用后CytC从线粒体膜间隙释放到胞浆内的量逐渐增加。见表2。4讨论恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，可发生在任何年龄段，发病率高，预后不良。不断发掘疗效好、毒副作用低的抗癌中草药是研究的新方向。笔者在前期研究中发现，穿心莲内酯可以抑制人SK

6、OV3、A431、HL-60细胞增殖，并可诱导SKOV3、A431细胞凋亡，其诱导凋亡可能与线粒体膜电位（MMP）下降有关［1-2］。本研究拟在前期研究的基础上，采用AnnexinV/PI双染法流式细胞术检测穿心莲内酯是否能诱导HL-60细胞凋亡、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对HL-60细胞细胞色素C（CytC）蛋白表达的影响。Annexin/PI双染法FCM检测结果发现，穿心莲内酯能促进HL-60细胞凋亡，且呈现良好的剂量依赖性；6.25、12.5μg/ml与溶媒对照组相比，早期凋亡率、晚期

7、凋亡率及坏死率差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞凋亡的信号转导机制十分复杂，其中最常见的就是线粒体通路。由该通路启动的细胞凋亡过程受许多蛋白质的调控，以CytC最常见。CytC是位于正常细胞的线粒体内、外膜之间。在细胞凋亡信号刺激下，CytC可从细胞的线粒体释放进入细胞的胞浆，这是线粒体凋亡通路的关键步骤。在各种刺激因素作用下，线粒体外膜通透性增加、线粒体通透性转变孔（MPTP）持续性开放、MPP逐渐降低，线粒体通透性转变孔开放后，线粒体基质会肿胀，线粒体外膜更易破裂，释放出细胞色素C等膜间蛋白，

8、最终引起细胞凋亡［3］。实验中我们发现，穿心莲内酯作用HL-60细胞24h后，CytC蛋白表达增加，且高浓度（12.5μg/ml）与溶媒对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。这一现象表明：穿心莲内酯作用下，可能使HL-60细胞线粒体膜通透性增高，从而使膜间隙蛋白CytC释放增加［4］。总之，本研究结果表明，穿心莲内酯能诱导HL-60细胞的凋亡。我们对其机制进行进一步研究中发现，在此过程中CytC蛋白释放增加，进而提示穿心莲内酯可能通过线粒体凋亡途径促进