关于真菌检测技术及其在诊断真菌性角膜炎中的应用

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1、关于真菌检测技术及其在诊断真菌性角膜炎中的应用　　【论文关键词】真菌性角膜炎检测技术诊断　　【论文摘要】真菌的检测技术从传统的形态学、免疫学发展到分子生物学水平，并逐渐应用于角膜真菌感染的研究。本文就全身及角膜真菌感染的检测技术研究进展作一综述，以期为寻求更为快速、特异、敏感的真菌性角膜炎的诊断手段提供帮助。　　　　真菌性角膜炎是一种严重危害视功能的感染性眼病，发病率逐年增加，治疗棘手。正确的早期诊断、治疗是取得良好疗效的关键。近年来，随着科技的进步和研究的深入，真菌的检测技术从传统的形态学、免疫学发展到

2、分子生物学水平，并逐渐应用于角膜真菌感染的临床和实验研究，有望为真菌性角膜炎的诊断提供更为快速、特异、敏感的途径。　　　　一真菌的检测技术　　　　（一）常规镜检及培养、鉴定　　1．镜检　　对临床标本的直接显微镜检查是最简单也是最有用的实验室诊断方法。直接镜检对于浅表和皮下真菌的感染最有帮助，可在几分钟内完成，并且很多情况下观察到的真菌形态可以提供很有价值的临床信息，还能给技术人员提供有效分离出可疑病原菌的有用信息[1]。直接镜检可采用不染色的湿片法如氢氧化钾（KOH）涂片或Gram染色涂片，染色检查包括革

3、兰氏染色、抗酸染色、Gimsa染色、PAS染色、组织病理染色、荧光检查和巴氏染色法等。　　2．培养、鉴定　　对临床标本直接镜检时不管看到什么，都应进行常规分离培养，必要时可使用辅助鉴定培养基。对致病真菌培养的目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，同时确定致病菌的种类，因此强调直接镜检与培养检查相结合[2]。常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄琼脂斜面培养基，加0.05%氯霉素，有时根据需要还可选用不同性质的培养基。　　真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。菌种的鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是不够的，有

4、时还需作生化反应、分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。　　（二）免疫学方法　　免疫学方法的基本原理是利用抗原与抗体的特异结合，来达到相互间的特异探察，是一种综合定性、定位和定量，形态、机能和代谢密切结合的研究和检测技术。该法主要用于检测真菌的抗原、抗体、代谢产物及细胞成分，能根据真菌抗原性的不同将真菌分类，但关键的是抗体的特异性。　　1．免疫组化　　免疫组化通过检测特异性真菌抗原诊断组织中的病原体，还可使组织中稀少存在的孢子更易发现。目前应用免疫组化检测的真菌主要有：（1）双相真菌，如孢子菌、皮炎

5、芽生菌、人类组织胞浆菌等；（2）酵母菌，如念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等；（3）丝状真菌，如曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌等。该法的缺点是容易发生交叉反应，所以，在评价免疫组化时，应列出抗体能检测的一系列真菌[3]。获得标准和经济适用的单克隆抗体可使该技术得到广泛应用。　　2．酶联免疫吸附试验（ELISA）　　ELISA是运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法，可根据不同的检测目的、试剂来源和实验条件，设计出多种类型的ELISA。如Diez等[4]采用一种新的特殊的单克隆抗体抑制酶联免疫吸附试验（in

6、h-ELISA）方法来诊断副球孢子菌，敏感性达80.4%，特异性达81.4%；Verplp蛋白[10]。　　(三)分子生物学技术　　1．原位杂交　　原位杂交利用核酸分子碱基配对互补的原则来检测目的基因，目前已用于念珠菌[11]、曲霉菌[12]等真菌感染的研究。真菌感染原位杂交检测的关键是探针的设计，目前所用的探针大多是合成的寡核苷酸探针，靶序列均为rRNA，不仅可以确定特异的病原体，而且可以判断其生命力。随着更多真菌的属特异和种特异探针的设计，将进一步提高它的敏感性和特异性，以用于临床协助作出快速准确的诊

7、断。此法的缺点是定量较困难，且不精确。　　2．聚合酶链反应（PCR）　　PCR技术自上世纪90年代开始用于真菌的检测，目前已广泛用于实验室、临床中各种真菌的研究。该技术能检测真菌的多糖、蛋白及DNA等，结合限制性内切酶分析能将临床真菌鉴定到菌种水平[13]，荧光定量PCR技术能对扩增产物进行定量分析[14]，针对真菌的共同序列而设计的“全能引物"可快速明确体内有无真菌感染[15]。PCR技术操作简便、省时省工，敏感性和特异性高，正逐渐成为临床上诊断真菌感染的常规技术。　　3．DNA中G+Cmol%含量测定

8、　　这是最早用于真菌分类学研究的分子生物学技术，因为每种真菌都有固定的DNAG+Cmol%范围，且较为稳定，数值随着真菌由低等向高等菌属进化而递增，因而可作为真菌的分类学指标。目前这一技术主要应用于酵母菌，其DNAG+Cmol%的属间差异范围界定为10%[16]。　　4．随机扩增多态性DNA(RAPD)分析[17]　　RAPD主要用于酵母菌和丝状真菌的鉴定、分类和流行病学研究，最明显的优点是不需要抽提大量DNA，从临床标本中可