左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与hpa轴活性作用的实验研究论文

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1、左归丸和右归丸对老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素表达与HPA轴活性作用的实验研究论文姚建平，金国琴，戴薇薇，姚龄爱，康湘萍【摘要】目的观察老年大鼠杏仁核促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）表达和血清皮质酮（CORT）含量变化和左归丸、右归丸对其的影响，探索老年肾虚大鼠CRH多肽表达与下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴活性的相关性及左归丸和右归丸的作用。方法以自然衰老SD雄性大鼠（24月龄）为肾虚衰老模型，大鼠随机分为老年对照组、左归丸组和右归丸组，每组35只.freelsLaboratories,

2、Inc）；中药（饮片）。1.3仪器垂直电泳及电转移装置（Bio-Radpany）；γ-射线计数仪（Beckmanpany）。2方法2.1动物分组、造模与给药105只SD雄性大鼠，随机分为3组：老年对照组、左归丸组、右归丸组，每组35只。另设青年对照组35只，共4组。温度18～22℃，光暗周期12h∶12h，群养，5只/笼，常规喂养饲料，自由饮水。以自然衰老SD雄性大鼠（24月龄）为模型，老年对照组大鼠常规喂养至24月龄。左、右归丸组大鼠从20月龄始，均按左、右归丸生药7.5g·kg-1（相当成人临床用量

3、的15倍）自由饮用稀释药液，每周停药两天，连续4个月。2.2药材及制剂左、右归丸组方及用量均参照《方剂学》第1版教材，原方用量（单位：g）左归丸：熟地24，山药12，枸杞子12，山茱萸12，川牛膝9，菟丝子12，鹿角胶12，龟甲12，右归丸：熟地24，山药12，山茱萸9，枸杞子9，菟丝子12，鹿角胶12，炒杜仲12，当归9，肉桂6，炮附子6。中药（饮片）一次性购于上海华宇药业有限公司，两方均按原方用量比例水煎，浓缩成膏，-30℃保存。2.3取材大鼠腹腔麻醉（25%乌拉坦，0.75mg/kg），用消毒手术

4、器械取大鼠杏仁核，置于高压蒸气灭菌的Eppendorf管中，-70℃保存。2.4SF(100μg/ml)液→转移到1.5ml离心管中并加40μl（10μg/μl）plete液→4℃，10000r﹒min-1，离心10min→取上清液，-70℃冻存→24h后，4℃，10000r/min，离心10min→取上清，分装，-70℃保存待测；蛋白样品浓度检测：参考马斯亮蓝试剂盒（南京建成）说明，595nm波长测各样品吸光值，参照公式“蛋白浓度=测定管吸光值/标准管吸光值×标准管浓度”检测各样品蛋白浓度；蛋白样品电

5、泳分离：取含蛋白40μg的样品（样品加1/5总体积的LB，最后用RIPA补齐至总体积至25μl，混匀后95℃煮5min）上样，在聚丙烯酰胺凝胶上（12%的分离胶，约3/5总体积，4%的堆积胶，约2/5总体积）电泳分离蛋白样品（100V，4℃，2h）；蛋白样品电转移及预染：按顺序安装好转膜装置（黑色板-海绵-三层滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-三层滤纸-海绵-红色板）。并完全排除气泡，4℃，100V转膜2h；将硝酸纤维素膜放入丽春红染液中染色约2～5min，去离子水漂洗至现出条带，用铅笔标出蛋白Marker位置

6、，再用去离子水振荡以去除染色；抗原抗体反应及显色：将膜转移至一培养皿中，37℃，用5%脱脂奶粉封闭1h（或4℃过夜）→将膜转移至塑料夹膜中，并加入1︰200稀释的兔抗大鼠CRH一抗→37℃摇床孵育约2h→0.1moL/L的PBST洗涤4次，每次5min→将膜转移至塑料夹膜中，并加入1︰400稀释的山羊抗兔辣根过氧化酶标记的二抗，37℃摇床孵育约30min→0.1mol/L的PBST洗涤4次，每次5min→将膜转移至塑料夹膜中，并加入DAB显色剂（显色时间视染色程度定）→去离子水洗膜；扫描及分析。2.5放

7、免法检测血清皮质酮按试剂盒说明操作，γ-射线计数仪检测cpm（管/min）。2.6数据、图像处理及结果分析artvieRNA［3］，CRH可增强杏仁中央核GABA能突触传递，这种效应是由CRH1受体介导的［4］。因此，推测杏仁核不是通过GABA能神经元抑制PVN，而是通过分泌CRH直接作用于下丘脑，兴奋性调控HPA轴功能。由于杏仁核不仅含有皮质类固醇受体，也含有丰富的CRH神经元。因此杏仁核可以接受HPA轴的糖皮质激素信息反馈，促进CRH的合成和分泌，参与HPA轴环路调节。本实验发现，与青年大鼠比较，老

8、年大鼠杏仁核CRH多肽表达和血清CORT含量显著增高，推测杏仁核可以通过皮质类固醇受体接受HPA轴终末激素GC的反馈信息，上调CRH多肽表达，发挥对HPA轴的兴奋性调控作用，可能是杏仁核对HPA轴行使兴奋性调控的重要机制，左归丸、右归丸可下调杏仁核CRH多肽表达，进而调节老年肾虚大鼠HPA轴功能紊乱。【