半重叠式多重引物pcr和基因扫描技术在t细胞淋巴瘤诊断中的应用

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1、半重叠式多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用作者：金贵善，全成旭，刘福生，柴奇【摘要】［目的］探讨半重叠式多重荧光多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用.［方法］从普通石蜡切片组织标本中提取基因组DNA，用半重叠式多重荧光多重引物PCR扩增，利用DNA测序仪对其产物进行基因扫描分析.［结果］37例T细胞淋巴瘤中27例检测出有克隆性重排;25例B细胞淋巴瘤中2例呈阳性;10例何杰金氏淋巴瘤和7例反应性增生病例均呈阴性.［结论］在T细胞受体γ基因重排克隆性检测中，半重叠式多重荧光多重引物PCR及基因扫描技术具有样本来源便利，灵敏度高，特异性强，耗时短等优点，

2、可作为T细胞淋巴瘤的诊断及鉴别诊断的辅助检测手段.【关键词】聚合酶链反应;淋巴瘤，T细胞;受体，抗原，T细胞，γ-δ;基因重排，T淋巴细胞免疫球蛋白基因和T细胞受体（TCR）基因克隆性重排已成为诊断淋巴系统恶性肿瘤常用的基因标志，而TCR基因重排检测可辅助诊断T细胞淋巴瘤.由于TCR的γ基因重排可出现在几乎所有的T淋巴细胞及T淋巴细胞瘤，且结构相对简单，故常用于T细胞的克隆性检测［1］.Southern杂交和聚合酶链式反应（PCR）均为重要的克隆性检测手段，其中Southern杂交法虽敏感且有特异性，但由于存在操作繁杂、耗时长及需使用新鲜组织等缺点，故广泛应用被受到限制.本实验采用可覆盖

3、所有TCR-γ链可变区（Vγ）和连接链（Jγ）的多重通用引物，经过半重叠式PCR扩增及基因扫描，给经HE形态学、免疫组织化学和Southern杂交法确诊的淋巴瘤患者石蜡包埋组织标本的TCR-γ基因重排进行了检测，探讨了它在T细胞淋巴瘤诊断中的应用价值.1材料与方法1.1标本来源及病理分类79例病理石蜡组织标本取自北京市神经外科研究所病理室，按照672（ABI373A，AppliedBiosystems，any）扫描分析软件进行分析.2结果2.1琼脂糖凝胶电泳组织标本基因组DNA首先经β-球蛋白引物扩增，证实所提取的DNA样本可用于下游实验时，再用TCR-γ的多重引物进行半重叠式PCR，扩

4、增产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳作初步鉴定，结果见Fig1.2.2DNA序列分析4例T细胞淋巴瘤样本的PCR产物片段经基因扫描结果分别显示绿色、蓝色、黄色和淡黄色的尖锐单峰，大小分别为258，182，162，150bp，根据颜色和bp大小判断应分别为VγⅠ，VγⅡ，VγⅢ，VγⅣ可变区的重排.经序列测定，并与基因库中T细胞γ受体基因序列（序列号为NG001336）进行比对，证实分别为Vγ2～Jγ2，Vγ9～Jγ2，Vγ10～Jγ2和Vγ11～Jγp1区间序列，与基因扫描结果一致.此结果囊括了4种可变区的序列，提示本项实验中所用多重引物可靠.2.3基因扫描选择琼脂糖凝胶电泳中阳性结果的样本

5、，进行基因扫描分析.扫描图中，狭窄的锐利单峰表示有克隆性重排;2个锐利的峰表示有2个等位基因的重排;多克隆重排显示为非特异性的宽峰;见Fig2.扫描图中黑色代表黄色荧光，红色峰为内参碱基长度标准Genescan-500ROX.37例T细胞淋巴瘤中27例检测出有γ受体的克隆性重排;25例B细胞淋巴瘤中2例检测出有TCR-γ受体的克隆性重排;10例何杰金氏淋巴瘤中和7例反应性增生病例标本中均未检出有TCR-γ受体的克隆性重排;见Table2.此结果与本室常规用Southern杂交方法检测的结果基本一致.　　3讨论以PCR技术为基础的克隆性检测已成为淋巴瘤诊断的重要辅助诊断手段.正常人或反应性

6、增生症等疾病病人淋巴细胞起源于多个克隆，基因重排方式多样，故PCR扩增产物片段长短不一，电泳后成弥散状，而肿瘤细胞为单克隆细胞，具有同一形式的基因重排，PCR产物经电泳后呈特异性条带.T细胞受体γ基因的重排发生在T细胞分化的早期，2种不同表型的T淋巴细胞（αβ和γδ）都存在着TCR-γ基因的重排，同时由于参与TCR-γ重排的基因片段数目少，故检测相对容易，被广泛应用于T细胞的克隆性检测.但是，由于TCR-γ受体重排时连接方式的有限性，导致TCR-γ不同克隆之间基因扩增产物的长度差别很小，有时仅在1个或数个碱基之间，普通的琼脂糖凝胶电泳很难将其区分开，容易造成假阳性.本研究中所采用的Gen

7、e-Scan分析方法具有高分辨能力，可检测出即使1个碱基差异的基因扩增产物，可有效地避免假阳性结果的出现，与传统的SSCP方法相比具有明显优势［2］.同时，由于采用了荧光标记引物，可更直观地判断重排发生所在可变区域，可用于疾病的追踪性研究.以往的许多研究多以VγⅠJ为引物进行TCR-γ基因片段的扩增，但由于少数T细胞淋巴瘤的重排是由VγⅠ-J1/2以外的基因片段参与的重排［3］，多重引物PCR方法可有效地避免由于引物设计缺陷造成的假