pcr检测人乳头瘤病毒的检测分析

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1、PCR检测人乳头瘤病毒的检测分析(哈尔滨市南岗区疾病预防控制中心微生物检验科黑龙江哈尔滨150001)【摘要】目的：探讨PCR检测人乳头瘤病毒的方法及注意事项。方法：对38例宫颈分泌物进行检测分析。结果：38例受检宫颈分泌物检测，其中检测岀HPV阳性34例，其中低危亚型10株，高危亚型24株。其中高危亚型HPV16型16例，HPV18型2例，HPV33型2例，HPV58型2例，HPV52型1例，HPV66型1例。低危亚型主要以HPV6和HPV11型为主。结论：PCR技术操作简便、出结果快、灵敏度高及特异性强，已广泛用于生命

2、科学的各个领域，在卫生检验中主要用于病原体的快速检验或不易培养的微生物的检测。【关键词】PCR检测；人乳头瘤病毒；注意事项【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1007-8231(2016)12-0229-02人乳头瘤病毒有多种型别，可感染人的皮肤和粘膜上皮细胞,诱发细胞增生,产生乳头瘤样病变，其中牛.殖道感染较为常见，除可能与口腔和生殖道癌症有关外，它所引起的尖锐湿疣是一种常见的性传播疾病，近年来发病率有明显增高,仅次于淋病，因此对该类病毒的早期诊断既有利于性病的预防又有助于某些癌症的发生［1］。现应用聚合酶

3、链反应(PCR)对人人乳头瘤病毒(HPV)感染的方法及检测注意事项进行分析。1.材料与方法1.1病列来源对2015年在我所体检的颖有HPV感染的子宫颈分泌物38例进行检测。年龄16〜71岁，平均年龄42岁。1.2标木采集使用扩阴器，先用棉拭子将多余宫颈分泌物擦去，再用一支棉拭子拭擦宫颈糜烂处，取出时不应碰阴道壁，放入盛lml无菌生理盐水的洁净试管中，加盖送检。1.3方法1.3.1模板的制备用无菌生理盐水润湿的棉签取阴道或宫颈部位的分泌物,将标本洗入生理盐水后，10000r/min离心5min，沉淀用30μl适当裂解液

4、重悬，保温后细胞裂解释放出DNA，离心取上清液5μl作为模板。1.3.2PCR反应体系与反应参数常用通用引物PL11-PL12扩增出450bp的特异性片段，可检出40多种人乳头瘤病毒。PL11：5′-CGTC-CAAGAGGAAACTGATC-3′。PL12：5′-GCACAGGGA-CATAATAATGG-3′。在反应体系中，除模板、引物、dNTPs和TaqD-NA聚合酶外，还需加入0.01%明胶和0.1%TritonX-100,以提高反应的特异性和产量。经94°C3

5、min预变性后，94°C变性lmin;55°C退火lmin;72°C延伸lmin;循环35次后，最后72°C延长7min,得到PCR产物。1.3.3PCR产物的检测使用1.5%琼脂糖或5%〜8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴化乙啶染色后，紫外灯下观察结果，出现450bp的扩增产物为检出阳性；如有必要，可用标记的寡核苷酸探针作Southern迹，以对该病毒进行分型。11亚型病毒常诱发生殖道湿疣和宫颈发育不良，而16,18,33型可能与U腔生殖道癌症有关。1.结果38例受检宫颈分泌物检测，其中检测出HPV阳性34例，其中低危亚型1

6、0株，高危亚型24株。其中高危亚型HPV16型16例，HPV18型2例，HPV33型2例，HPV58型2例，HPV52型1例，HPV66型1例。低危亚型主要以HPV6和HPV11型为主。2.讨论人生殖道HPV感染较为常见，不同型HPV引起的感染具奋不冋的临床表现。其中低危组(HPV6.11)多诱发良性湿统，高危组(HPV16.18)病毒通常整合到宿至基因组中，可启动癌基因，从而导致恶性肿瘤。因此，检测组织损害部位中是否存在HPV显得非常重要。迄今HPV难于病毒培养及血清学检测，实验诊断主要靠核酸探针分子杂交。近年发展起来的

7、实时荧光PCR技术，已结合了探针杂交的特异性，又具有较高的灵敏性，II可快速分型，为HPV的检测提供新的方法。临床常用于区分良性与恶性皮损，并可早期诊断亚临床感染。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备、引物的质量与特异性，酶的质量及PCR循环条件等。只冇兼顾各因素，才能确保稳定的结果。在实验中通过设置阳性对照以兼控实验各因素，如阳性对照正常，应考虑模板中是否含奋较多杂蛋白或者有酚等Taq酶抑制剂，或靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合［2】。如阳性对照带不清楚或未出现，则应考虑：①是否因酶的活性丧失或不够；②两条

8、引物设计是否合理，如引物长度不够、引物之间形成二聚体等；③是杏因多次冻融或长期存放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④是否因引物的浓度不对称造成低效率的不对称扩增；⑤是否因Mg2+浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带；⑥变性温度低，变性吋间短，极奋可能出现假阴性；⑦退火温度过高