半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠tgfβ1及timp1表达的影响论文

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1、半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠TGFβ1及TIMP1表达的影响论文李中华，赵晓芳，李圭，余胜明【摘要】目的研究半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1表达的影响。方法P-1含量变化。结果半枝莲水煎液各治疗组与模型组相比肝纤维化程度显著减轻;半枝莲中、高剂量治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1水平又显著低于模型组(P0.01)。结论半枝莲水煎液能够显著降低免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1表达。【关键词】免疫性肝纤维化;半枝莲水煎液;Ⅰ、Ⅲ型胶原;TGF-β1;TIMP-1半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellari

2、abarbataD.Don的全草，微苦，凉，通气道、水道，有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、利尿和抗癌等作用.freelm)备用。秋水仙碱(Colchicine)德国进口，上海医药公司分装，批号:1155-2002。TGF-β1型和TIMP-1型免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，TGF-β1和TIMP-1单克隆抗体试剂编号分别为BA0290、BC01140(操作均按试剂盒说明书进行)。1.3半枝莲水煎液制备①将原料粉碎为粗末后，浸泡12h以上(水浸过药面2cm)。②武火煮沸后改用文火煎30min，冷却30min后滤渣取汁。将滤渣如上法再煎煮2次取汁。③将3次药汁混合，用文火

3、浓缩至500ml，所制得半枝莲水煎剂，每毫升含生药1g，置冰箱4℃备用，使用前按要求配成所需浓度。2方法2.1动物分组随机取2只作为正常对照组。剩余大鼠进行肝纤维化造模,于第4周末组及造模大鼠各随机处死2只证实肝纤维化形成后,将其余造模大鼠随机分为模型组、半枝莲水煎液低、中、高各剂量治疗组、秋水仙碱对照组共5个组，每组10只。2.2造模方法本实验采用腹腔注射猪血清复制免疫性肝纤维化大鼠动物模型的造模方法，注射无菌猪血清0.3ml/100g体质量，2次/周，共8周。但有所改进:采用高脂低蛋白食物(用玉米面为饲料，加0.5%胆固醇，实验第1、2周加20%猪油)，10%酒精为唯一饮料，为了防

4、止肝脏自然修复对实验结果的影响，各组于用药开始后仍每周注射无菌猪血清0.3ml/100g体质量1次(正常对照组除外)。2.3给药方法各组给药情况如下：4周后，正常对照组和模型组灌服同容积的生理盐水;半枝莲低、中、高剂量各治疗组分别灌服半枝莲0.25，0.5，1g/100g体质量;秋水仙碱对照组:灌服秋水仙碱10μg/100g体质量;以上各组灌胃液体量为1ml/100g体质量，1次/d，共8周，其浓度及等效剂量按体表面积折算。2.4标本制备各组分别于用药治疗后8周，于8周末最后1次注射猪血清后禁食48h后称重,使用颈椎脱臼法处死大鼠,剖取肝脏,置于4%聚甲醛固定液中待用。2.5观测指标及

5、测定方法2.5.1常规肝组织病理学检查将各组石蜡包埋、切片均作常规HE染色，光镜下观察肝组织改变及胶原纤维的分布，同时采用王宝恩等3肝纤维化的分级法进行人工量化。2.5.2免疫组织化学检查将取出的肝组织用4%多聚甲醛固定24h，梯度脱水之后透明石蜡包埋。采用热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0.01mol/L构椽酸缓冲液，微波炉加热沸腾15min热修复，冷却后0.01mol/LPBS溶液洗涤3次，滴加二抗及血清封闭液，室温20min，滴加稀释一抗，4℃冰箱保存过夜，滴加SABC试剂，DAB显色，蒸馏水清洗，苏木素轻度复染，梯度脱水、透明、封片，光镜观察。每次染色时用试剂公司提供的TG

6、F-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TTMP-1阳性片作阳性对照，PBS代替第一抗体作为阴性对照。免疫组化结果均使用专业图像分析软件测定平均光密度值，用背景的光密度值减去阳性部位的光密度值即为阳性部位的吸光度值。2.5.3免疫组织化学染色Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1免疫组织化学染色，染色过程中设阴性对照，阴性对照以PBS代替一抗，DAB显色。2.5.4统计学分析各组资料分析应用完全随机设计的单因素方差分析。统计结果采用SPSS11.0软件包处理。3结果3.1肝纤维化程度分级0级:无胶原纤维组织增生;Ⅰ级：汇管区有少量纤维组织增生，纤维组织短而细;Ⅱ级：汇管区有较多纤维组织增生;Ⅲ级：汇

7、管区有大量纤维组织增生，呈窄带状，并向肝小叶周围伸展;Ⅳ级：汇管区有大量纤维组织增生，呈宽带状，伸展包绕或分割肝小叶，中央静脉有偏位现象。分级结果见表1。表1各组肝组织纤维化分级结果只3.2免疫组化染色观察3.3Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化观察正常对照组:肝脏Ⅰ型胶原阳性染色少见于汇管区纤维和中央静脉壁管,Ⅲ型胶原及纤维主要存在于大血管周围;模型组:肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原表达显著增加,可见于众多视野,其着色较深,.freelad-dependentandSm