半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠tgfβ1及timp1表达的影响

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1、半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠TGFβ1及TIMP1表达的影响作者：李中华，赵晓芳，李圭，余胜明【摘要】目的研究半枝莲水煎液对免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1表达的影响。方法Wistar大鼠72只随机分为正常对照组、模型组和半枝莲水煎液低、中、高剂量治疗组及秋水仙碱对照组共6组;采用猪血清腹腔内注射构建肝纤维化大鼠模型,肝组织切片HE染色后,光镜下观察大鼠肝组织纤维化程度;免疫组化染色法(SABC型)观察肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1含量变化。结果半枝莲水煎液各治疗组与模型组

2、相比肝纤维化程度显著减轻;半枝莲中、高剂量治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1水平又显著低于模型组(P<0.01)。结论半枝莲水煎液能够显著降低免疫性肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1及TIMP-1表达。【关键词】免疫性肝纤维化;半枝莲水煎液;Ⅰ、Ⅲ型胶原;TGF-β1;TIMP-1　半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellariabarbata9D.Don的全草，微苦，凉，通气道、水道，有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、利尿和抗癌等作用，用于治疗咽喉肿痛，肿瘤，阑尾炎，肝炎，肝硬化腹水，肺脓疡，吐血，衄血

3、，血淋，肾炎水肿等[1];据《中华肿瘤治疗大成》载，半枝莲主治原发性肝癌等消化道肿瘤、肺癌及子宫颈癌等妇科肿瘤，在广西民间有用其治疗肝炎、肝纤维化的用药习惯。我们前期实验结果研究表明半枝莲提取物对四氯化碳所致大鼠肝损伤具有保护功能[2]，本实验在此基础上，采用腹腔注射猪血清复合法制备免疫性肝纤维化大鼠动物模型的方法，通过免疫组化的方法，观察该药对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原、转化生长因子-β1(TGF-β1)及基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)表达的影响,进而阐明对大鼠肝纤维化治疗作用及机制，为开发廉价有效的治疗

4、化学性肝损伤药物提供理论依据。　　1材料　　1.1动物健康清洁级Wistar雄性大鼠72只，体质量220～2500g。由广西医科大学实验动物中心提供,合格证号:桂医动第11006号。　　1.2药品与试剂半枝莲原料，由南宁市医药公司提供，经广西中医学院药学院生药教研室刘寿养教授鉴定确认后，粉碎为粗末(Φ1～3mm)备用。秋水仙碱(Colchicine)德国进口，上海医药公司分装，批号:1155-2002。TGF-β1型和TIMP-1型免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，TGF-β1和TIMP-1单克隆抗体试剂编号

5、分别为BA0290、BC01140(操作均按试剂盒说明书进行)。9　　1.3半枝莲水煎液制备①将原料粉碎为粗末后，浸泡12h以上(水浸过药面2cm)。②武火煮沸后改用文火煎30min，冷却30min后滤渣取汁。将滤渣如上法再煎煮2次取汁。③将3次药汁混合，用文火浓缩至500ml，所制得半枝莲水煎剂，每毫升含生药1g，置冰箱4℃备用，使用前按要求配成所需浓度。　　2方法　　2.1动物分组随机取2只作为正常对照组。剩余大鼠进行肝纤维化造模,于第4周末组及造模大鼠各随机处死2只证实肝纤维化形成后,将其余造模大鼠随机分为模型组、半

6、枝莲水煎液低、中、高各剂量治疗组、秋水仙碱对照组共5个组，每组10只。　　2.2造模方法本实验采用腹腔注射猪血清复制免疫性肝纤维化大鼠动物模型的造模方法，注射无菌猪血清0.3ml/100g体质量，2次/周，共8周。但有所改进:采用高脂低蛋白食物(用玉米面为饲料，加0.5%胆固醇，实验第1、2周加20%猪油)，10%酒精为唯一饮料，为了防止肝脏自然修复对实验结果的影响，各组于用药开始后仍每周注射无菌猪血清0.3ml/100g体质量1次(正常对照组除外)。　　2.39给药方法各组给药情况如下：4周后，正常对照组和模型组灌服同容

7、积的生理盐水;半枝莲低、中、高剂量各治疗组分别灌服半枝莲0.25，0.5，1g/100g体质量;秋水仙碱对照组:灌服秋水仙碱10μg/100g体质量;以上各组灌胃液体量为1ml/100g体质量，1次/d，共8周，其浓度及等效剂量按体表面积折算。　　2.4标本制备各组分别于用药治疗后8周，于8周末最后1次注射猪血清后禁食48h后称重,使用颈椎脱臼法处死大鼠,剖取肝脏,置于4%聚甲醛固定液中待用。　　2.5观测指标及测定方法　　2.5.1常规肝组织病理学检查将各组石蜡包埋、切片均作常规HE染色，光镜下观察肝组织改变及胶原纤维的

8、分布，同时采用王宝恩等[3]肝纤维化的分级法进行人工量化。　　2.5.2免疫组织化学检查将取出的肝组织用4%多聚甲醛固定24h，梯度脱水之后透明石蜡包埋。采用热修复抗原SABC染色程序，切片浸入0.01mol/L构椽酸缓冲液，微波炉加热沸腾15min热修复，冷却后0.01mol/LPBS溶液洗涤3次，滴