陕西地区乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型论文

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1、陕西地区乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型论文.freelerasechainre-action;polymorphism，restrictionfragmentlengthAbstract:AIMToinvestigatethegenotypesofHepatitisBvirus（HBV）inShaanxiprovince.METHODSThe585bplengthofHBVSgeneplifiedfromthebloodsamplesof100patientserasechainreaction（PCR）.ThePCRproductses，BsrⅠ，StyⅠ，DpnⅠandHpaⅡ

2、todeterminethegenotypingofHBV.RESULTSByPCR-RFLP，HBVfrompatientsainlyconsistsoftypeBandtypeC，andtypeDisrareinthisregion.0引言已知乙型肝炎病毒（HBV）可分为A，B，C，D，E，F，G7个基因型［1-3］，我国主要以B型和C型为主，D型比较少见，少数民族多以D型为主，还未发现其他型别［4］.人类感染不同基因型HBV可能与感染途迳、疾病的感染谱及疾病的进展有一定的相关［5］.目前进行HBV分型的方法主要有3种:①病毒全基因组或S基因序列测定和分析［1，2］;②聚合酶链式

3、反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）［6］;③单克隆抗体酶联免疫吸附法［7］.由于病毒基因测序法技术较为复杂，不便于临床或流行病学调查工作中常规应用;单克隆抗体分型法则难以从基因水平上对HBV进行分型，因此我们选用PCR-RFLP进行HBV的基因型别鉴定，以了解陕西地区HBV流行毒株的型别和特点.1对象和方法1.1对象选取本院保存的陕西籍慢性乙型肝炎患者血清标本100（男62，女38）份;年龄4～60（平均32.4±4.2）岁.全部标本HBsAg阳性，临床诊断标准符合第五届全国传染病和寄生虫病学术会议制定的病毒性肝炎防治方案.1.2检测方法1.2.1血清HBV-DNA的

4、提取取20μL血清加40μLDNA裂解液，在沸水中煮10min，离心后吸取上清液待检.1.2.2套式PCR外引物核苷酸（nt）序列为:S1（nt2820-2837，5’-GGGACACCATATTCTTGG-3’）和S2（nt842-822，5’-TTAGGGTTTAAATGTAT-ACCCA-3’）;内引物的nt序列为:P1（nt203-221，5’-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3’）和P2（nt788-768，5’-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3’），所有引物均由天津九鼎鑫公司合成.1.2.3PCR扩增及限制性内切酶酶切分析两轮套式PCR按常规进行.第

5、1轮PCR反应系统组成为:待检上清液4μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，S1/S2各1.5μL，加无离子水至50μL反应体积.扩增条件:94℃预变性300s，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共扩增35个循环.第2轮PCR反应系统组成为:第1轮反应产物4μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，P1/P2各1.5μL，Taq酶2U，加无离子水至50μL反应体积.扩增条件和循环次数同第1轮PCR［8-10］.扩增的靶基因经琼脂糖电泳初步鉴定粗纯后分成若干份，选择限制性内切酶StyⅠ，BsrⅠ，HpaⅡ，DpnⅠ分别或组合进行酶切［11］，取消化产

6、物8～10μL加入20gL-1琼脂糖凝胶上进行电泳，根据不同的电泳图谱进行RFLP分析以确定HBV基因型.2结果2.1基因型与S基因限制性片段长度多态性的关系经用内引物P1和P2扩增获得的的靶基因片段长度为585bp（Fig1），其中HBVC基因型在此片段中的第301位有限制性内切酶StyⅠ的酶切位点，识别序列为C■C（A/T）（A/T）GG，应分解为332bp和253bp两个片段;HBVB基因型毒株在第174位有BsrⅠ的酶切位点，识别序列为C■CAGT，可被分解为126bp和459bp两个片段，依此可准确鉴定B型（Fig2）;92%A型和100%E型在此片段的第348位有BsrⅠ

7、酶切位点，可被切成300bp及285bp两个片段，HpaⅡ仅在E型第552位有酶切位点，识别序列为C■CGG，被切成81bp和504bp两个片段，可准确鉴定100%E型;DpnⅠ在C型中无酶切位点，在全部A，B，E及95%D型第337位有酶切位点，识别序列为GA■TC，被切成289bp和297bp两个片段，可准确鉴定95%D型;但独在F型第337位和593位有酶切位点，被切成257bp，289bp，40bp三个片段;可准确鉴定97%F型.StyⅠ，BsrⅠ