陕西地区乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型

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1、陕西地区乙型肝炎患者血清中病毒的基因分型关键词:肝炎病毒，乙型;基因型;聚合酶链反应;多态性，限制性片段长度摘要:目的了解陕西地区乙肝病毒（HBV）基因分型情况.方法用套式PCR方法从100份HBsAg阳性的乙型肝炎患者血清中扩增585bp的S基因，用限制性内切酶BsrⅠ，StyⅠ，DpnⅠ和HpaⅡ平行酶切鉴别HBVA～F基因型.结果所有标本用内引物P1和P2均扩增获得的585bp的靶基因，继之用上述限制性内切酶消化鉴定，证明100份血清标本中的HBV可分为B型36份（36%），C型56份（56%），D型8份（8

2、%）.结论陕西地区HBV分型以B，C型为主，D型较少，未发现A，E，F型.结果同时表明PCR-RFLP方法灵敏性高，特异性强，且酶切图谱简明单一，易于识别，适用于HBV基因型的流行病学调查和临床实验研究.　　Keyerasechainre-action;polymorphism，restrictionfragmentlength　　Abstract:AIMToinvestigatethegenotypesofHepatitisBvirus（HBV）inShaanxiprovince.METHODSThe585bpl

3、engthofHBVSgeneplifiedfromthebloodsamplesof100patientserasechain　reaction（PCR）.ThePCRproductses，BsrⅠ，StyⅠ，DpnⅠandHpaⅡtodeterminethegenotypingofHBV.RESULTSByPCR-RFLP，HBVfrompatientsainlyconsistsoftypeBandtypeC，andtypeDisrareinthisregion.　　0引言　　已知乙型肝炎病毒（HBV）可分为A

4、，B，C，D，E，F，G7个基因型［1-3］，我国主要以B型和C型为主，D型比较少见，少数民族多以D型为主，还未发现其他型别［4］.人类感染不同基因型HBV可能与感染途迳、疾病的感染谱及疾病的进展有一定的相关［5］.目前进行HBV分型的方法主要有3种:①病毒全基因组或S基因序列测定和分析［1，2］;②聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）［6］;③单克隆抗体酶联免疫吸附法［7］.由于病毒基因测序法技术较为复杂，不便于临床或流行病学调查工作中常规应用;单克隆抗体分型法则难以从基因水平上对HBV进

5、行分型，因此我们选用PCR-RFLP进行HBV的基因型别鉴定，以了解陕西地区HBV流行毒株的型别和特点.　　1对象和方法　　1.1对象选取本院保存的陕西籍慢性乙型肝炎患者血清标本100（男62，女38）份;年龄4～60（平均32.4±4.2）岁.全部标本HBsAg阳性，临床诊断标准符合第五届全国传染病和寄生虫病学术会议制定的病毒性肝炎防治方案.　　1.2检测方法　　1.2.1血清HBV-DNA的提取取20μL血清加40μLDNA裂解液，在沸水中煮10min，离心后吸取上清液待检.　　1.2.2套式PCR外引物核苷酸

6、（nt）序列为:S1（nt2820-2837，5’-GGGACACCATATTCTTGG-3’）和S2（nt842-822，5’-TTAGGGTTTAAATGTAT-ACCCA-3’）;内引物的nt序列为:P1（nt203-221，5’-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3’）和P2（nt788-768，5’-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3’），所有引物均由天津九鼎鑫公司合成.　　1.2.3PCR扩增及限制性内切酶酶切分析两轮套式PCR按常规进行.第1轮PCR反应系统组成为:待检上清液4μL，

7、10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，S1/S2各1.5μL，加无离子水至50μL反应体积.扩增条件:94℃预变性300s，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共扩增35个循环.第2轮PCR反应系统组成为:第1轮反应产物4μL，10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，P1/P2各1.5μL，Taq酶2U，加无离子水至50μL反应体积.扩增条件和循环次数同第1轮PCR［8-10］.扩增的靶基因经琼脂糖电泳初步鉴定粗纯后分成若干份，选择限制性内切酶StyⅠ，BsrⅠ，HpaⅡ，DpnⅠ分别或组合

8、进行酶切［11］，取消化产物8～10μL加入20g・L-1琼脂糖凝胶上进行电泳，根据不同的电泳图谱进行RFLP分析以确定HBV基因型.　　2结果　　2.1基因型与S基因限制性片段长度多态性的关系经用内引物P1和P2扩增获得的的靶基因片段长度为585bp（Fig1），其中HBVC基因型在此片段中的第301位有限制性内切酶StyⅠ的酶切位点，识别序