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《抗大豆ⅱ号亚型钙调素单克隆抗体的制备与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、抗大豆Ⅱ号亚型钙调素单克隆抗体的制备与鉴定作者：王红吴萌赵宝华赵亚朴【关键词】大豆;,钙调素;,亚型;,单克隆抗体 [摘要]目的:制备抗大豆Ⅱ号亚型钙调素(SCaM2)单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法:从含有pSCaM2的大肠杆菌BL21中,提取并纯化SCaM2。以其作为抗原免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞经细胞融合、筛选及克隆化,建立稳定分泌SCaM2mAb的杂交瘤细胞株,并对抗SCaM2mAb进行鉴定。结果:经两次细胞融合,共获得10株可稳定分泌抗SCaM2mAb的杂交瘤细胞株。对其中3株杂交瘤细胞制备的腹
2、水mAb（6F11F3、7C5E9、7E10E2）,用间接ELISA及免疫印迹实验表明,在高稀释度时,mAb6F11F3可识别SCaM1和SCaM2,而mAb7C5E9和7E10E2可分别识别SCaM4和SCaM5。Ig亚类鉴定结果表明,mAb6F11F3和7C5E9均为IgG2a,mAb7E10E2为IgG1。相加实验的结果显示,mAb6F11F3和7C5E9可能识别SCaM2相同的抗原表位;而mAb7E10E2可能识别不同的抗原表位。mAb6F11F3对SCaM2的亲和常数为（2.127±0.418）×106M-1,mAb7C5E9对
3、SCaM4的亲和常数为（9.69±2.406）×106M-1,mAb7E10E2对SCaM5的亲和常数为（1.203±0.429）×107M-1。结论:制备了可识别不同SCaM亚型的mAb6F11F3、7C5E9及7E10E2,为研究SCaM的特性及功能提供了重要的制剂。 [关键词]大豆;钙调素;亚型;单克隆抗体 植物钙调素(CaM)有多种亚型,它们在生化特性、组织分布及生物学功能等方面具有各自的特性。通过对不同亚型CaM进行亚细胞定位,可了解各个亚型CaM的意义,并在此基础上研究不同亚型CaM在植物生长发育过程中的作用及调节机制。我
4、们制备了抗大豆2号亚型CaM（SCaM2）的单克隆抗体(mAb)并对其特性进行了鉴定。 1材料和方法 1.1材料质粒pSCaM2和大肠杆菌BL21（DE3）由河北师大细胞学实验室惠赠。BALB/c纯系小白鼠,由河北医科大学实验动物中心提供。Sp2/0Ag14小鼠骨髓瘤细胞,由河北省科学院生物所提供。牛血清白蛋白、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG及HT、HAT、胎牛血清,均购自华美生物工程公司。IPTG为InaIC公司产品。标准低分子量蛋白、Phenylsepharose4B疏水亲和层析柱为Pharmacia公司产品。弗氏完全佐剂、不完全
5、弗氏佐剂、TMB、DMEM培养基、IgG亚类检测试剂盒为Sigma公司产品。其他试剂为进口分装或国产分析纯试剂。 1.2方法 1.2.1SCaM2的提取与纯化参照 1.2.5mAb识别的抗原表位分析采用间接ELISA相加实验进行测定[5]。先用间接ELISA法测定纯化的mAb与包被抗原反应的饱和浓度。以SCaM2为抗原包被酶标板,前两孔分别加入两种mAb,其A值分别记录为A1和A2,第3孔先以其中1种饱和量的mAb于室温作用2h,洗涤后再与另一种mAb作用2h。洗涤后,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,于37℃保温2h,洗涤后加
6、TMB显色,A450值记录为A1+2,计算相加指数AI=[2A1+2/(A1+A2)-1]×100%。每组重复试验3次,取其平均值。AI>50%者,即认为2株mAb识别不同的抗原表位。 2结果 2.1杂交瘤细胞系的建立取纯化的SCaM2免疫BALB/c小鼠,经两次细胞融合,反复筛选及再克隆化共获得10株可稳定分泌抗SCaM2的mAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清液的特异性,10株杂交瘤细胞培养上清液均可与SCaM1、SCaM2、SCaM4及SCaM5出现反应,其中3株（6F11F3、7C5E9、7E10E2
7、）的A值与其他各株相比较差异较明显,并且效价也较高。因此,对此3株杂交瘤细胞进行了鉴定。 2.2mAb一般特性的鉴定(1)Ig亚类鉴定:mAb6F11F3和7C5E9属于IgG2a,mAb7E10E2属于IgG1。(2)效价测定:3株mAb6F11F3、7C5E9、7E10E2的腹水效价,分别为10-5、10-4、10-4。(3)特异性鉴定:①ELISA法的结果表明,mAb6F11F3稀释到1∶32000时,仅与SCaM1、SCaM2出现反应;mAb7C5E9、7E10E2分别稀释到1∶64000和1∶32000时,分别与SCaM4、S
8、CaM5出现反应。②1、SCaM2出现条带,差异不显著;mAb7C5E9、7E10E2与SCaM4、SCaM5均出现两条带,但mAb7C5E9与SCaM4反应出现的条带更深;而mAb7E10E
