脑通复方对血管性痴呆大鼠海马尼古丁受体的影响

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1、脑通复方对血管性痴呆大鼠海马尼古丁受体的影响作者：肖雁，王晓亮，邓婕，闫秀明，黄勇，况时祥，官志忠【摘要】目的观察脑通复方制剂对拟血管性痴呆(VaD)模型大鼠脑组织神经型尼古丁受体（Nicotinicacetylcholinereceptors，nAChR）的影响，分析脑通复方制剂改善血管性痴呆学习记忆能力的作用机制。方法采用改良Pulsinelli四血管阻断（Pulsinelli'sfour-vesselocclusion,4-VO）法复制大鼠血管性痴呆模型，脑通复方制剂治疗后观察学习记忆能力，orris水迷宫检测学习记忆能力。结

2、果发现脑通复方制剂对血管性痴呆大鼠空间学习记忆减退有明显防治作用，并从神经型胆碱能受体方面初步探讨防治作用的机制，为脑通复方制剂临床防治VaD提供实验室依据。　　1材料与仪器　　1.1动物健康清洁级Sprague-Dag，成人用药量5mg/d，批号：070308A。以上药品实验前用双蒸水配制成所需浓度的混悬液，4℃冰箱保存，皆灌胃给药。　　1.3仪器及试剂Morris水迷宫（DNS-2型），由中国医学科学院药物研究所提供。羊抗α4、α7，兔抗α3多克隆抗体及HRP标记的抗羊、抗兔及抗鼠二抗购自美国SantaCruzBiotechno

3、logyInc公司；鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体购自美国Sigma公司；聚乙烯二氟（Polyvinglienefluoride,PVDF）膜、ECL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Amersham公司。　　2方法　　2.1动物筛选与分组大鼠适应性喂养1周后，先进行Morris水迷宫训练。第1～4天行定向航行实验，每天将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的顺序单独放入水中，站台置于第Ⅰ象限，记录60s内大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期；第5天行空间探索实验，记录2min内大鼠在第Ⅰ象限游泳时间和穿越站台次数。选取学习能力、记忆力相近的大

4、鼠，淘汰4只大鼠。将余下大鼠56随机分出12只作为假手术组，其余44只采用改良Pulsinelli四血管阻断(4－VO)法制造血管性痴呆大鼠模型。　　2.2VaD模型的复制大鼠于术前禁食12h，不禁水。用10%水合氯醛(300mg·kg-1体质量)腹腔麻醉大鼠,将大鼠俯卧固定，行背侧颈正中切口,逐层钝性分离，暴露双侧第一颈椎横突翼小孔,用直径0.5mm的电凝针插入双侧翼小孔烧灼双侧椎动脉,造成永久性闭塞。然后，再将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口,钝性分离双侧颈总动脉,以“4”号丝线穿线备用。24h后，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉

5、5min,共夹闭3次,每次间隔1h。局部伤口缝合前，以青霉素局部喷洒处理防止感染，术后3d给予青霉素20万U·只-1肌肉注射抗感染,常规饲养、观察。假手术组手术程序同上，仅暴露4条血管,但不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭。　　2.3动物分组4-VO术后死亡和淘汰共8只，实际成模为36只，根据随机数字表随机分为3组：模型组12只，脑通复方制剂组12只，安力申组12只。假手术组和模型组均灌服等量生理盐水；防治组给予脑通复方制剂8g·kg-1·d-1，用双蒸水配制浓度为0.55g生药/ml的混悬液；西药对照组给予安力申0.625mg·kg-

6、1·d-1，用蒸馏水配制为0.1mg/ml的混悬液；各组均每天分两次灌胃给药，灌胃体积为1.0ml·100g-1，连续灌药1月。　　2.4学习记忆能力测试于大鼠手术及造模后第5周再次进行Morris水迷宫检测，检测方法同前。　　2.5nAChRα3，α4，α7亚单位蛋白水平取海马组织，在玻璃匀浆器中，加入冰预冷的5mlBufferA（50mmol/LTris,50mmol/LNaCl,2mmol/LEDTA,pH7.40，10%trixton-100）及PMSF和复合蛋白酶抑制剂，于冰上制成脑组织匀浆，并置于冰上1h，使脑组织细胞充

7、分溶解，用含有蛋白酶抑制剂的50mmol/LPBS(pH=7.4)制备细胞匀浆，12000r/min4℃,离心40min，小心吸取上清液至EPP管，用考马斯亮蓝法对上清液进行蛋白定量。取10%海马组织匀浆进行J，PakrasiS，etal.Alterationsinnicotinicalpha4beta2receptorbindinginvasculardementiausing(123)I-5IA-85380SPECT:parison.