比浊法快速测定硫酸多黏菌素e效价

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1、比浊法快速测定硫酸多黏菌素E效价作者：佟斌吴兆亮殷昊赵艳丽【摘要】研究比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速测定方法，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h。当硫酸多黏菌素E的效价为30～100u/ml时，检测菌液接种浓度为5%，培养时间为4h，吸光度对数值与抗生素效价具有良好的线性关系。本法重现性好，相对误差小于5%。【关键词】硫酸多黏菌素E比浊法效价FastdeterminationofthepotencyofpolymyxinEbyturbidimetryassayABSTRACTAturbidimetryassayforfastdetermin

2、ationofpolymyxinEpotencyetryassaydecreasedthedeterminationtimefrom20hoursto4hours.ThereyxinEandthelogarithmofabsorbencyintherangeof30～100u/mlandinoculatingconcentratione.Theturbidimetryassayhadagoodreproducibility,andtherelativeerroryxinE;Turbidimetryassay;Potency多黏菌素E(polymyxinE或colistin)是由多黏芽孢杆

3、菌抗敌素变株(Bacilluspolymyxinvar.colistinus)经发酵培养生产的一种环状多肽类抗生素，它对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用［1］。由于多黏菌素E具有高效、低毒、残留少的特性，将其硫酸盐制成兽药用于防治由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌等革兰阴性菌［2］引起的肉鸡、猪、牛等畜禽的肠道疾病。目前采用杯碟法［3，4］测定其生物效价。杯碟法操作步骤复杂，耗时长，测定时间需要大约20h，不能快速反馈工业生产中各个阶段产品生物活性，必须开发一种快速测定硫酸多黏菌素E效价的方法。比浊法是抗生素效价微生物检定的方法之一［5～8］，其原理是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的

4、液体培养基内，混匀后，经短期培养，测量培养物的吸光度，在一定线性范围内细菌培养物吸光度的对数值logA与抗生素的浓度成正比，比浊法具有检测快速的特点。本文深入研究了比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速检测方法。1材料与方法1.1材料(1)检定菌大肠埃希菌(CMCC(B)44102)购自微生物菌种保藏中心。(2)硫酸黏杆菌E素(硫酸多黏菌素E)标准品中国兽医药品监查所提供，批号K02700902，效价19536u/mg。(3)主要仪器752紫外分光光度计；恒温水浴振荡器；牛津杯(不锈钢，高100mm，外径8.0mm，内径6.0mm)；PHS3C精

5、密pH计。1.2方法(1)检定培养基的制备称取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氢二钾3.3g，磷酸二氢钾1g，氯化钠4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水至1000ml加热混匀，调节pH值为7.2，过滤，115℃灭菌30min。(2)检测菌液的制备取大肠埃希菌的琼脂斜面培养物一支，加0.9%灭菌生理盐水1ml洗下菌苔转入茄瓶，37℃培养18～22h，用0.9%灭菌生理盐水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度计上波长为600nm处用0.9%灭菌生理盐水调节菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接种量接种至检定培养基作为检测菌液。(3)硫酸多黏菌素E标准溶液的

6、配制精确称取硫酸多黏菌素E标准品，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到600u/ml，再用水稀释成浓度分别为30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种浓度的标准溶液。(4)比浊法吸光度测定精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml检测菌液，放入恒温水浴摇床以200r/min转速37℃振荡培养一定时间，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处［9］分别测定吸光度。(5)比浊法样品检测将样品稀释到适当浓度后，按实验1.2.(4)中有关步骤操作测定吸光度，在吸光度对数效价标准曲线上查对应的效价，乘以稀释倍数，即

7、得到样品的效价。2结果与讨论2.1检测条件的选择(1)大肠埃希菌生长曲线的测定将大肠埃希菌菌液分别以2.5%、5.0%和10%的接种量接入检定培养基，37℃条件下以200r/min振荡培养，在600nm处每小时检测一次培养物的吸光度，结果如Fig.1所示。大肠埃希菌在自然状态下生长时延迟期一般为1h左右，这一时期菌体生长缓慢，菌量基本上维持在最低水平；然后进入指数期，这一时期大约持续7～8h，这一时期菌体生长速率常数最大，生长最迅速