格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体atp敏感性钾通道的影响

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1、格列吡嗪对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道的影响【摘要】目的：探讨格列吡嗪（Glip）对正常及糖尿病大鼠心肌线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）的影响.方法：取分离鉴定的SO）（Amresco公司）；HEPES，ATP（Roche）公司；Percoll（Pharmacia公司）；二氮嗪（Diazoxide），鱼藤酮、寡霉素（Sigma公司）；高速冷冻离心机（Beckman公司）；723型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）.1.2方法1.2.1线粒体制备大鼠禁食过夜,断头处死,迅速取出

2、心脏.依据Riess等〔4〕的方法提取线粒体,略作改动,简述如下：用少量冰预冷分离介质(250mmol/L蔗糖,10mmol/LHEPES,5mmol/LKEGTA,用NaOH调pH至7.2)漂洗心脏,在含1g/L蛋白酶的分离介质中剪碎心脏至肉糜状,分离介质用5g/L牛血清白蛋白调整至2.5倍体积,用匀浆器制成匀浆液,1700g离心4min,取上清液9000g离心5min,将沉淀吹打重悬浮于分离介质中,2300g离心2min,收集上清液,9000g离心5min,得到线粒体沉淀,将沉淀重悬浮于不含KEGTA的

3、分离介质中.采用自发形成Percoll密度梯度的方法进一步纯化线粒体.最后将所得线粒体沉淀以蛋白浓度35~40g/L悬浮在不含KEGTA的分离介质中,冰浴中保存备用.以上操作均在0~4℃进行,从动物处死到首次离心间隔少于4min.参照Castilho等〔5〕方法，用测定线粒体内膜关键酶琥珀酸脱氢酶活性法进行线粒体鉴定.双缩脲法测定线粒体蛋白浓度.1.2.2线粒体体积测定用定量光散射技术测定线粒体体积变化.当线粒体悬浮液中线粒体蛋白浓度为0.1g/L时,在经过蛋白浓度无限大时吸光度值校正后,线粒体悬液光散射值β

4、与溶液在520nm，25℃的吸光度值的倒数呈线性相关〔4〕.因此反映线粒体体积变化的线粒体悬液β值可由这两个吸光度值计算所得〔6〕.实验中线粒体悬液为含K+待测溶液,包括120mmol/LKCl，10mmol/LHEPES，0.1mmol/LEGTA，10mmol/L琥珀酸盐，0.5mmol/LMgCl2，5mmol/L磷酸盐，5μmol/L鱼藤酮，0.67μmol/L寡霉素，200μmol/LATP(KATP阻滞剂),pH7.2.取分离鉴定的SO中,在本实验条件下,0.5mL/LDMSO对实验结果无影响.统计

5、学处理：数据以x±s表示,应用SPSS13.0软件进行统计学分析,两组间均数比较应用t检验,两组以上均数比较应用方差分析,方差齐性用最小显著差法(LSD)检验,P0.05为差异具有统计学意义.2结果2.1各组大鼠心肌线粒体体积随时间的变化各组的线粒体悬液光散射值(β值)均随时间有程度不等升高（图1，2）.各大鼠心肌线粒体悬液光散射值β在空白对照组上升速度非常缓慢,在加入二氮嗪后速度明显加快.两者在eierJJ,GallidtitochondrialK(ATP)channelsincellsurvivalandd

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