水稻nerd途径关键基因osnerd1的功能研究

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1、水稻NERD途径关键基因OSNERD1的功能研究陈雄平（华中农业大学作物遗传改良重点实验室，武汉４３００７０）摘要：ＲｄＤＭ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）是一种存在于植物中转录水平的基因沉默（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＴＧＳ）机制，需要ＤＣＬ３、ＲＤＲ２及ＡＧＯ４／６等多种蛋白介导ｓｉＲＮＡ同源位点的甲基化。拟南芥中发现了独立于ＲｄＤＭ的一条新ＴＧＳ途径，其关键蛋白为ＡｔＮＥＲＤ１。ＡｔＮＥＲＤ１能够与ＡＧＯ２蛋白相互作用，产生２１ｎｔ的ｓＲＮＡs分子，介

2、导某些新近进化基因的甲基化，并影响其组蛋白修饰。序列同源比对结果表明，水稻中存在有与ＡｔＮＥＲＤ同源非常高的蛋白，分别命名为ＯｓＮＥＲＤ１和ＯｓＮＥＲＤ２。体外结合试验结果表明，ＯｓＮＥＲＤ的ＰＨＤ结构域能够结合Ｈ３Ｋ４ｍｅ３，ＯｓＮＥＲＤ１参与下游基因的表观调控。对ＯｓＮＥＲＤ突变体中一些转座子的检测表明，该基因的突变会影响转座子的表达量变化及其表观修饰，并且这些转座子集中在ｇｙｐｓｙ家族，gｙｐｓｙ家族转座子在营养核中表达活跃，可能与ＯｓＮＥＲＤ１的花粉不育相关。..关键词：ＮＥＲＤ；ｓＲＮＡ；ＲｄＤＭ；转座

3、子；ＤＮＡ甲基化中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７４文献标识码：A：0439－８114（２０15）04－0988-05DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.04.057收稿日期：２０１４－０８－０８简介：陈雄平（１９８８－），男，湖南娄底人，在读硕士研究生，研究方向为水稻表观学，（）１５９２１１１２８５７（电子信箱）ｃｈｅｎｘｐ＠ｗｅｂｍａｉｌ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。ｓＲＮＡｓ是一种广泛存在于动植物中非编码ＲＮＡ（Ｎｏn－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ），在调控基因表达中发挥着重要的作用［１-３

4、］。其中，ＲｄＤＭ（ＲＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）是联系表观修饰与ｓＲＮＡs的一条重要途径。ＲｄＤＭ通过产生２４ｎｔ的ｓＲＮＡs介导ｓｉＲＮＡ起始位点及其同源位点基因组ＤＮＡ的甲基化来实现对基因表达的调控，该过程依赖ＤＣＬ３和ＡＧＯ４／６［４］。水稻（Oryzasative）中也发现了一些ｍｉＲＮＡ同样可以介导内源性同源位点的ＤＮＡ甲基化［５］。此外，拟南芥中高通量数据中也发现一些ＲｄＤＭ途径的靶位点，不仅产生２４ｎｔ的ｓＲＮＡｓ，还可以产生２１ｎｔ的ｓＲＮＡｓ［６］，这些发现使ｓＲＮＡｓ

5、介导的ＤＮＡ甲基化更为复杂和多变。拟南芥ＡｔＮＥＲＤ１蛋白的发现给ｓｉＲＮＡ介导的ＤＮＡ甲基化和组蛋白修饰变化的研究提供了新方向。ＡｔＮＥＲＤ１的作用依赖于ＲＤＲ１／ＲＤＲ６以及ＡＧＯ２，而ＲＤＲ１／ＲＤＲ６及ＡＧＯ２目前只发现其在外源ｓｉＲＮＡ途径中发挥着作用［７］。因此，ＡｔＮＥＲＤ１通过ＲｄＤＭ以外的途径对基因组中的基因进行调控表达，且该途径可能影响植物性状和对外界环境适应性的表观变异与遗传。ＮＥＲＤ途径在作物中是否保守目前仍然未在其他植物中报道，本研究通过序列比对在水稻中发现了两个与ＡｔＮＥＲＤ１同源的蛋

6、白，一个为ＯｓＮＥＲＤ１突变体，突变体表型表现为花粉不育，其转座子表达量发生了改变，相应的甲基化修饰以及组蛋白修饰也发生了改变。１材料与方法１．１材料１．１．１突变体研究使用的突变体为韩国突变体，编号为３Ｄ－００３７０，Ｔ－ＤＮＡ插入位点为第一个外显子，材料背景为Ｄｏｎｊｉｎｇ。１．１．２引物研究所用引物见表１。１．２方法１．２．１序列比对及进化树进化树分析中水稻的蛋白质序列来自于ＭＳＵ（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ），其他各种植物的蛋白序列于网站Ｐｈｙ

7、ｔｏｚｏｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ．ｎｅｔ／），采用ＣｌｕｓｔｅｒＸ软件进行多序列比对，并用ＭEＧＡ３．１构建进化树。１．２．２ＲＴ－ＰＣＲ利用引物ｑｂ２ＮＤ１－Ｆ／Ｒ、ｑａ１ＮＤ１－Ｆ／Ｒ检测ＯｓＮＥＲＤ１基因插入位点后的表达量，具体步骤见..