失血性休克肠上皮细胞线粒体dna atpase 6

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1、失血性休克肠上皮细胞线粒体DNAATPase6-->提　要:目的　观察失血性休克大鼠肠上皮细胞mtDNAATPase6,8亚基基因的改变。方法　将6只ANDU7500紫外分光光度计定量。1•6　PCR检测肠上皮细胞mtDNAATPase6,8基因突变1•6•1　PCR引物　　上海博亚生物工程公司设计并合成。　　1A:5′-ACAATGACATGCCACAAC-3′,1B:5′-GGGAA-CATAATAATGGTCAC-3′;2A:5′-AAACGAATAACCCTTGAGAATC-3

2、′,2B:5′-TG-GTGGGTCATTATGTGTTATC-3′。分别组成两对引物,扩增248bp和715bp。1•6•2　PCR方法　　PCR标准反应体系总体积为50μl。条件如下:加入10×buffer5μlMgCl2(25mmol/L)3•6μl,4×dNTP3•6μl,引物(0•5μl/μg)各1•4μl,模板(0•3μg/μl)10μl,PCR用水27μl,液状石蜡23μl,95℃预变性220s,加入TaqDNA聚合酶0&#

3、8226;9μl。循环条件,95℃变性40s,72℃延伸36s(扩增715bp时为60s),55℃退火30s,反应30个循环,72℃延伸10min。1•6•3　PCR产物鉴定　　用2%琼脂糖凝胶,取4μl产物与1μl上样液混合后点样,与BDLadderMarker比较。100V,4min;55V,20min后紫外灯下观察并拍照。将PCR产物送北京博大泰克等公司进行序列测定。2　结果2•1　mtDNA的紫外吸收光谱分析　　mtDNA样品浓度为11~14μg/μl。D260/D280为1&

4、#8226;75~1•80。2•2　PCR产物电泳图谱　　大鼠肠上皮细胞ATPase6,8基因扩增产物大小分别为715bp和248bp,强弱基本一致,所处位置相同,见图1。2•3　ATPase8亚基基因序列测序结果　　大鼠肠上皮细胞mtDNAATPase8基因序列共检测6个动物20份标本,将结果与Rattusnorvegicus(itochondrialgenome进行相似性比较,见表1。结果说明两组大鼠均见有7871位碱基C突变为T(C7871T)(同义突变),标本检出比为15/20

5、,动物检出比为5/6。2•4　ATPase6亚基基因序本论文出自列测序结果　　大鼠肠上皮细胞mtDNA7904~8584区域ATPase6亚基基因序列检测结果报告,共检测6个动物6份标本,见表2。结果进行相似性比较,发现T8083C,G8204A,T8251C,C8289T,C8557G基本上在所有大鼠中均检测到了。休克缺血缺氧大鼠除发现1例同义突变C8344T外,还发现1例突变T8505G,使编码氨基酸改变,使缬氨酸变为甘氨酸。2•5　休克大鼠肠上皮细胞ATPase6,8基因的改变　　失血性休克

6、5h,大鼠肠上皮细胞ATPase6,8基因发生了突变,突变情况及其意义如下,。2•6　大鼠肠上皮细胞ATPase6,8基因的多态性　　本实验所采用的大鼠是由北京中国药品生物制品鉴定所实验动物中心(国家物种中心)提供的封闭种群itochondrialgenome比较,几处位点碱基均有改变,见表4。3　讨论　　线粒体是细胞的能源中心。在细胞凋亡,衰老及程序化死亡中发挥重要作用。mtDNAATPase6,8基因是编码F0F1-ATPase复合物F0部分的基因。本实验研究了肠上皮细胞mtDNAATPase6,8基因的

7、多态性和休克时的突变情况。3•1　失血性休克大鼠肠上皮细胞ATPase6,8基因的改变意义　　mtDNA通常与线粒体内膜结合,编码呼吸链的一些必要成分。在多种疾病中发现mtDNA发生突变。本实验结果表明,见表3,ATPase8基因7797位点A发生缺失,休克组缺失率为3/3,而对照组为0/3,提示本突变和缺血缺氧密切相关,该突变会使mRNA的阅读框架发生改变,其结果可使氨基酸的组成发生改变,生成功能异常或无功能的ATPase8亚基蛋白,直接影响了F0F1-ATPase的活性。而7934~7935插入C也会造成

8、相同后果。本研究还发现该基因构象的其它改变,7863位碱基由A变为G(A7863G),编码-->的第40位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸(苏氨酸40丙氨酸)。　　ATPase6基因在失血性休克5h时,C8294G,谷氨酰胺130谷氨酸;T8505G,缬氨酸200甘氨酸。这些突变只在休克组中发现,说明与缺血缺氧也有一定关系。