睾丸灌注超低温冷冻对家兔移植睾丸功能的影响

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1、睾丸灌注超低温冷冻对家兔移植睾丸功能的影响【关键词】睾丸移植超低温冷冻精子生成睾酮兔Abstract:ObjectiveTostudytheeffectofcryopreservationonthefunctionoftransplantedrabbittesticle.MethodsThetestesatogenesisallevel,andthespermatogenesiscontinuedlongerthan2months.ConclusionByusinghigh-concentrationcryoprotectantandin

2、vivoperfusion,itislikelytoeffectivelyprotectthestructureandfunctionofthegrafttestis.Aftertransplantation,thetestiscouldsecretetestosteroneclosetonormallevelandmaintainalong-timespermatogenesis.Keyatogenesis;testosterone;rabbit随着器官移植工作的广泛开展，使器官的需求大大增加，仅新鲜器官移植已不能满足日渐增长的临床需要

3、，器官的冷冻保存可使临床器官移植更为方便、快捷，是临床器官移植的有效保障。在既往器官冷冻保存移植工作的基础上［1～3］，我们进行了家兔睾丸的超低温冷冻保存及移植试验。1材料和方法1.1实验动物及手术方法10～18月龄性成熟日本大耳白兔（徐州医学院实验动物中心），体重3.5～4.0kg，按常规方法饲养管理，精子及睾酮检测无异常。实验动物随机分为低浓度体外、高浓度体外、低浓度活体和高浓度活体4组进行睾丸灌注。睾丸灌注后连同输精管和睾丸动静脉一起采摘后进行冷冻。受体家兔皮下注射速眠新（0.2ml/kg）麻醉，睾丸动静脉采用11-0尼龙线在手术显

4、微镜下行端端吻合，输精管在手术显微镜下用9-0尼龙线行端端吻合。开放动脉后血流运行达睾丸静脉，则定为血流再通；血流运行通过静脉吻合口并且血运持续10min以上则定为睾丸移植成功。1.2冷冻保护剂的配制高浓度冷冻保护剂中含有2.5mol/L甘油和2.5mol/L二甲基亚砜（DMSO）以及质量浓度为12%的蔗糖；低浓度冷冻保护剂由1.1mol/L甘油配制。1.3睾丸灌注体外灌注为器官采摘后的灌注，其方法是在睾丸摘除后，经睾丸动脉插管灌注冷冻保护剂，睾丸由肉红色转为淡红色。活体灌注是在器官采摘前完成灌注，其方法是将27G注射针插入并固定于睾丸动

5、脉内，缓缓将冷冻保护液注入，睾丸在直视下由肉红色迅即变为碧玉色，即为器官完全灌注，随即结扎睾丸静脉，将睾丸摘除。摘除后的睾丸置于冷冻保护液（室温）中再平衡40min后进入程序冷冻。1.4程序冷冻冷冻过程分为4个降温区段，每个区段使用不同的降温速度，具体如下：①20℃～4℃，降温速率1.5℃/min；②3℃～-17℃，降温速率0.5℃/min；③－18℃～－35℃，降温速率2.5℃/min；④－36℃～－196℃，降温速率4.0℃/min。1.5复苏过程将睾丸从液氮中取出移入37℃解冻液中，温育30min，然后将其移入室温下的PBS液中，继

6、续温育20min。如解冻后睾丸外观保持完整，则定为睾丸完整。1.6精子采集与计数当受体家兔性行为恢复后，在自然爬跨过程中用人工阴道采集精液，取部分精子用精子计数板计算总数；刚果红染色后在光镜下观察，不着色者为活精子，被红染的精子为死亡精子，计算活精子占总数的比例为精子活率。1.7血浆睾酮水平检测晨9：00采家兔耳缘静脉血500μl，天津九鼎生物工程公司放射免疫试剂盒检测血浆睾酮水平。1.8统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，组间数据进行方差分析，P﹤0.05为差异有显著性。2结果2.1不同浓度冷冻保护剂及灌注方法对睾丸完整

7、率及血流再通率的影响不同浓度冷冻保护剂及不同灌注方法对解冻后睾丸的完整率有显著影响，活体灌注和应用高浓度的冷冻保护剂可提高睾丸的完整率。见表1。表1不同浓度冷冻保护剂及灌注方法对睾丸完整及血流再通的影响2.2睾丸移植获得28只完整冷冻睾丸。自体移植22只：7只开放血流后睾丸未形成血液循环，1只静脉损伤严重，移植失败；14只移植成功。异体移植6只：1只开放血流后睾丸未形成血液循环，1只静脉血管损伤严重，移植失败；4只移植成功。见表2。表2冷冻睾丸分组移植情况2.3睾酮水平由于手术打击及疾病等原因，部分家兔术后死亡；由于血管栓塞等原因，部分移

8、植睾丸术后坏死或功能丧失。睾丸移植后，睾丸功能保持的家兔体内的睾酮水平接近正常。见表3。表3冷冻睾丸移植后睾酮水平2.4术后性行为的恢复及精子分析移植睾丸后，部分家兔7天后即可恢复性行为。自体