普通pcr与tdpcr在临床医学科研中应用价值

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1、普通PCR与TDPCR在临床医学科研中应用价值【摘要】　　目的比较普通聚合酶链反应（PCR）与降落聚合酶链反应(Touchdoerasechainreaction(PCR)andtouchdoedicalresearch.MethodsicDNAfromhumanperipheralbloodastemplatesanddesignedthreepairsofprimersofVHLgenethreeexons.OnthebasisoftheprincipleofPCRandTDPCR,s,includingthethr

2、eeexons.eprogramsents.ThePCRproductsethodsbysequencingpurifiedPCRproducts.ResultsItorespecificandeffectivethanordinaryPCR,accordingtoelectrophoresisdetectionandsequencinganalysis.ConclusionTDPCR,ethod,ismoreefficientthanordinaryPCRforclinicalgenemutationscreening.

3、　　Keyerasechainreaction;touchdoerasechainreaction　　自从20世纪80年代中期以来，聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)作为一种体外扩增DNA的方法，在分子生物学、法医学及一些人类基因疾病诊断等方面起到越来越重要的作用。PCR所具有的3个突出的特点（即选择性，特异性和快速性），使得DNA的克隆和操作变得十分简单。目前在一些临床基因突变筛查研究中，PCR作为基本实验手段，得到了广泛的应用,尽管如此，许多PCR实验中不但经常出现假阳性，而且实验结果

4、往往并不太令人满意，也会造成无PCR产物，或电泳中出现大量非特异性二聚体条带。降落聚合酶链反应(TouchdoixTaqHotStartVersion）25μl，100μmol/L上下游引物各0.2μl，基因组DNA100～200ng，灭菌超纯水20.6μl。　　1．3PCR扩增试剂及仪器本次实验中使用的DR028APCR混合浓缩试剂中含有的TaKaRaTaqHs是抗Taq抗体和TaKaRaTaq的混合物，高温变性前抗Taq抗体与Taq酶结合，抑制聚合酶活性，能在低温条件下抑制引物的非特异性退火及引物二聚体的非特异性扩增，抗

5、Taq抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，无需特殊失活处理，在常规PCR条件下即可使用，同时PCR扩增产物3’末端含有一个“A”碱基，可直接连接T载体克隆。PCR所用仪器为美国ABI公司GeneAmpPCRSystem9700型。　　1．4设计降落PCR程序R产物均在2.0%(质量分数)琼脂糖凝胶中电泳，固定电压100V。　　1．7纯化及测序使用上海生工技术有限公司DNA胶回收试剂盒SK1132纯化PCR产物后，送该公司测序，所用测序仪器为ABIPRISM3730，测序试剂为BigDyeterminatorv3.1。

6、　　2结果　　本次实验中用于扩增VHL基因的3个外显子和测序的引物见表1。TDPCR产物电泳结果未见非特异性二聚体，目的条带清晰明亮，见图1。普通PCR产物电泳结果可见大小约100bp左右的非特异性二聚体，同时加样孔下方带有部分片状拖带产物，目的条带较明亮清晰，见图2。TDPCR产物纯化后测序结果准确可靠，基本未见干扰波，见图3。普通PCR产物纯化后测序结果较准确可靠，在碱基G与A可见一蓝色干扰波，见图4。　　表1用于扩增VHL基因的3个外显子和测序的引物（略）　　F：正向；R：反向　　图1TDPCR产物电泳结果（略）

7、　　图2普通PCR产物电泳结果（略）　　图3TDPCR产物纯化后测序结果（略）　　图4普通PCR产物纯化后测序结果（略）　　3讨论　　1991年Don等报道的TDPCR代表一种优化方法，其与普通PCR操作基本一致，只是编设一系列退火温度从较高温度开始逐步降低的循环反应程序，一组反应程序可同时扩增出不同特异性靶基因序列片段，并获得理想的扩增效果。该方法的基本原理是在设定程序时选择退火温度高于计算的Tm值10℃，随着循环的进行逐步降至Tm值，最终低至Tm值或低于Tm值5℃。这一方法可保障第一个引物与模板杂交发生在最互补的反应

8、物(目的扩增片段)之间，任何不同的变性温度与不同的复性温度之间循环，能得到2倍增高的正确或不正确的产物，在随后的退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。最初设计TDPCR是为了降低普通PCR中出现的假阳性，因此TDPCR常用于存在假阳性的临床检测。此后PiraeeM等人应用