肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与toll样受

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1、肝肾综合征大鼠肾组织葡萄糖调节蛋白与Toll样受【摘要】目的:探讨肾组织葡萄糖调节蛋白78、94（GRP78、94）和Toll样受体4（TLR4）的表达及其在肝肾综合征发生中的作用。方法:采用胆总管结扎诱导肝硬化及肝肾综合征大鼠模型（BDL组）,术后1、2、4和6周各选6只大鼠取血及组织标本。从股静脉取血,监测血浆丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（TBil）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。用ELISA检测血浆肿瘤坏死因子α（TNFα）含量。取肝、肾组织称其质量,并制备标本;用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、蛋

2、白质019178）:上游5′CCAAGAACCTAGATCTGAGC3′;下游5′GGACATGTAAACCAGTCATG3′。GRP78引物（489bp,U16277）:上游5′GGCGGATCGTGCCTCTCATT3′;下游5′GACCAGTCGCTCAGCAGTCA3′。GRP94引物（460bp,BC011439）:上游5′CCATGGCTTATATCCACTTC3′;下游5′GTAATGTCAGTTGAATGGTG3′。βactin引物（270bp,NM031144）:上游5′GTA

3、GCCATCCAGGCTGTGTT3′;下游5′GAAGTCTAGGGCAACATAGC3′。　　1.2.2大鼠肝肾综合征模型构建　　SD大鼠饲养1周后,随机分为2组。实验组（BDL组）用胆总管结扎法诱导肝硬化［1］:戊巴比妥腹腔麻醉SD大鼠,开腹暴露胆总管,用丝线在胆总管远、近端结扎,于两结扎中间剪断胆总管,关腹。假手术组（Sham组）仅开腹,暴露胆总管但不剪断,再关腹。两组分别在术后1、2、4、6周各取6只大鼠称体质量,股静脉采血测血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBI）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR

4、E）及TNFα含量;然后用戊巴比妥腹腔麻醉后处死取肝、肾并称体质量。200mg肾组织置于-70℃液氮保存备用;肝、肾组织各500mg以100g/L甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木素伊红（HE）染色。由两位病理医师双盲评价肝、肾组织病理。　　1.2.3检测方法　　ALT、TBI、BUN、CRE于TMS1024全自动生化仪检测。　　1.2.4ELISA检测血浆TNFα的含量　　按说明书进行操作,检测样本A450值,用TNFα标准液绘制曲线,从曲线中得出各样本TNFα含量。　　1.2.5总RNA抽提和RTPCR　　

5、肝组织匀浆、TRIzol抽提RNA,禽类成髓纤维病毒逆转录酶（AMV酶）42℃逆转录。25μLPCR反应体系,βactin为内参照。扩增参数:94℃5min;94℃40s,56℃(GRP78)/50℃(GRP94)/52℃(TLR4)40s,72℃90s,35循环;72℃5min。DL2000marker确定PCR产物大小,电泳。置凝胶电泳处理系统（YLN2000）成像,TanonGis2.0软件半定量分析GRP78/βactin、GRP94/βactin、TLR4/βactin灰度比值。　　1.2.6蛋白质抽提

6、及mliSDS（十二烷基硫酸钠）缓冲液,将样本放沸水振荡水浴5min,100g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。将蛋白转到尼龙膜上,将膜放入含50mL/L脱脂牛奶的TrisHCl缓冲液37℃孵育1h。更换新鲜50mL/L脱脂牛奶Tris缓冲液（TBS）,加入山羊抗大鼠GRP78（1∶2000）/GRP94（1∶2000）/TLR4(1∶2000)、GADPH（1∶3000）mAb,37℃孵育2h,10mL/L脱脂牛奶TBS溶液洗膜4次,每次15min,分别加入过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG（1∶2000）室温振

7、荡孵育1h,压片、定影、显影、洗片。　　TanonGis2.0软件半定量分析GRP94/GADPH、TLR4/GADPH灰度比值。　　1.2.7统计学处理　　计量资料以x±s表示,用SPSS10.0统计软件包进行方差分析、配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1肝肾综合征模型的评价　　BDL组各时间点大鼠的肝脏、肾脏质量均较Sham组明显增加（P<0.05）。组织病理结果表明,BDL组在术后第4、6周出现典型的肝硬化表现;Sham组各时间点均无假小叶形成;两组大鼠术后各时间点肾组织无明

8、显病理变化。BDL组术后各时间点ALT、TBI含量均较Sham组明显升高（P均<0.05）;术后1周、2周BDL组BUN、CRE含量无明显变化（P>0.05,vsSham组）,但在4、6周却明显升高（P<0.05,vsSham组）。结果见表1。表1BDL组、Sham组术后组织及生化结果（略）　　2.