基于转录组数据的大鲵免疫功能基因的发掘及est

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1、基于转录组数据的大鲵免疫功能基因的发掘及EST第一章文献综述1.1大鲵研究进展中国大鲵（Andriasdavidianus），俗称娃娃鱼，隶属于属脊索动物门，两栖纲（Amphibiu），有尾目（Vrodtla），隐鳃鲵科（Cryptobranaachidae），是现存最大的有尾两栖类动物，同时也是我国的珍惜保护动物。大鲵是一种水生到陆生的过度类型，且其结构比较原始和独特，因此在研究生物进化和生物多样性等方面有重要的科学价值。大约30多年前，大鲵曾经广泛的分布于中国的中南部各省的峡谷山溪中（北纬23.5–35

2、°，东经100–120°）（赵尔宓1998;章克家etal.2002;arguliesetal.2005）、Illumina/Solexa测序（Bentley2006）和ABI/SOLiD测序技术（Ondovetal.2008）。Roche/454FLX是最早出现的高通量测序技术平台，被广泛的应用于各物种的转录组分析中（Veraetal.2008;Meyeretal.2009;Craftetal.2010）。和其他2个后来出现的测序平台相比（Illumina/Solexa和ABI/SOLiD

3、），Roche/454FLX最大的优点在于它序列的读长最长（400-500bp），而相对较高的测序成本和相对较低的数据产出量（0.5~1Gb/run）是这个平台的缺陷。Illumina/Solexa和ABI/SOLiD虽然读长相对较短（75bp左右，现在可能已经在100bp以上），但是它们平均运行一次所产出的数据量（600G/run）却远远超过Roche/454FLX，而且测序成本也大大降低（Mardis2008;ShendureandJi2008;Ansorge2009）。在过去的几年时间里，Solexa和SOLiD

4、技术被认为只能对有参考基因组的物种进行重测序。然后，随着这两个测序平台的不断进步以及序列组装软件的更新，利用极短读长片段（ultra-short-reads）进行组装进而进行转录本的分析已得到广泛的应用。第二章大鲵皮肤和脾脏转录组测序及转录本分析2.1引言作为现存最古老、体型最大两栖动物，中国大鲵在脊椎动物的系统发育进程和免疫系统进化过程中扮演着关键性的角色，因此在转录组组水平上研究大鲵的免疫机制和遗传背景对于进一步了解物种起源和系统发育过程具有重要意义。而目前大鲵的研究主要集中在其的分类（陈云祥2007）、生物学特性

5、（刘孝华2009）、营养（王立新等2011b）、病害防治（叶小丽2001）、生理（郭永灿等2005）等方面，而公共数据库中有关大鲵的遗传信息和基因序列的匮乏，使得针对大鲵基免疫机制和遗传背景的研究尤为困难。在过去的十几年时间里，学者们利用cDNA文库筛选的方法来获得特定时期、特定组织器官的EST序列，但是文库筛选的方法操作比较复杂且所获得的基因序列数目是有限的，因此对于遗传信息匮乏的物种来说还远远不够。RNA-Seq技术是在第一代测序基础上发展起来的新一代测序技术，由于其测序速度快，数据产出通量高等特点（Metzker

6、2010），已经被广泛的应用于功能基因的发掘、表达差异分析、分子标记的筛选、可变剪切的检测、基因融合的检测及基因转录调控机制等研究中（岳桂东等2012a），为大鲵等无参考基因组的生物的快速获得大量遗传信息提供了新的思路。本研究利用Illumina聚合酶合成测序方法对大鲵脾脏和皮肤进行转录组测序分析，并在此基础上以利用所获得的转录组数据进一步发掘大鲵免疫相关功能基因，以期为今后进一步研究大鲵免疫防御机制和分子机理提供资料；同时开发并开发一批新的SSR位点，今后研究大鲵群体的遗传特征和群体结构，构建高密度大鲵遗传连锁图谱，

7、免疫抗病相关性状的定位和进行分子标记选择育种提供基本资料。2.2材料方法2.2.1实验动物1尾3龄（体长41cm，体重345g）健康大鲵来自陕西省汉中市留坝县。首先将其麻醉，然后再在无菌条件下取其皮肤和脾脏组织置于1.5ml灭菌离心管中，迅速投入液氮中冷冻，最后置于-80oC冰箱中保存。2.2.2主要生物信息分析软件Trinity软件：序列组装拼接；Blat软件：unigene同源性比对；EMBOSS软件：unigeneORF预测；MISA软件：SSR分子标记筛选；IDEG6软件：基因差异表达分析；Perl脚本；Bla

8、st2GO软件：对基因或蛋白质序列进行功能