舟山眼镜蛇毒l氨基酸氧化酶的分离纯化、理化及酶学性质

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1、舟山眼镜蛇毒L氨基酸氧化酶的分离纯化、理化及酶学性质：林丽珊,张志强,陈洲,许云禄【摘要】目的从舟山眼镜蛇蛇毒中分离L氨基酸氧化酶(LAO),测定其理化和酶学性质。方法应用SephadexG100凝胶色谱和POROSCM20离子交换色谱分离纯化LAO;20阳离子交换填料预装柱(POROS20,美国AppliedBiosystems公司);BioCAD纯化工作站(美国AppliedBiosystems公司);自动部分收集器(BSZ100)和恒流泵(HL1,上海沪西分析仪器厂);恒温摇床(美国Forma公司);紫外分光光度计(美国Biorad公司);试剂均为进口或国产分析纯。1.2方法

2、1.2.1眼镜蛇蛇毒的凝胶色谱SephadexG100凝胶柱(2.6cm×100cm)用HAcNaAc缓冲液(pH5.8,0.05mol/L+NaCl0.05mol/L)预先平衡过夜。称取眼镜蛇粗毒0.5g溶于10mL双蒸水,4℃静置过夜,4℃10000r/min离心10min。取上清液凝胶柱,用HAcNaAc缓冲液洗脱,流速16mL/h。收集洗脱液,4mL/管,根据D(280nm)值绘出洗脱曲线。1.2.2凝胶色谱组分LAO活力按文献[5]介绍的流程和反应体系进行分离组分酶活力测定。凝胶色谱洗脱组分0.1mL与L苯丙氨酸反应,以终产物的光密度值[D(300nm)]为指标，以反应体系中

3、加HAcNaAc缓冲液0.1mL取代蛇毒组分为未加酶对照。一个活力单位定义为在上述条件下得到0.03D300nm所需的酶量。1.2.3LAO纯化合并经凝胶色谱收集的具有LAO活性的组分。以POROS20进行纯化。线性梯度洗脱(A液:0.05mol/L,pH5.8的HAcNaAc缓冲液;B液:含有0.5mol/LNaCl的平衡液),收集洗脱蛋白峰,浓缩和脱盐。测定POROS20离子交换层析各组分的LAO活性,收集具有活性的组分,用POROS20离子交换层析,以0.02mol/L,pH6.2的HAcNaAc缓冲液平衡,线性梯度洗脱(A液:0.02mol/L,pH6.2的HAcNaAc缓冲液

4、;B液:含有0.5mol/LNaCl的平衡液),进一步纯化,收集活力峰,浓缩、透析脱盐。1.2.4LAO纯度鉴定及相对分子质量按碱性不连续系统进行。样品按是否含有2%β巯基乙醇分为还原性和非还原性两种。在Hoefer电泳仪上电泳2h,稳流12mA/10cm×10cm。常规染色脱色。在ImageMasterVDS凝胶成像系统上依据标准蛋白绘制标定曲线,计算相对分子质量。1.2.5蛋白质浓度采用文献[11]方法,将待测蛋白质溶液适当稀释,在波长260nm和280nm处分别测出D值,然后利用280nm和260nm波长下的吸收差求出蛋白质的浓度。蛋白质浓度(mg/mL)=1.45D(280nm)-0

5、.74D(260nm)1.2.6LAO对温度和pH适应性最适pH测定:在pH6.0~10.0缓冲液中,其他条件不变,测定酶活力。最适温度测定:酶液在0.4moL/L,pH7.8的TrisHCl缓冲液中,测定20,30,40,50,60和70℃下的酶活力。以酶活力最高者为100%,其余折算为最高活力的百分数,并以pH或温度为横坐标,最高活力百分数为纵坐标,绘制酶活力适应曲线。1.2.7LAO米氏常数(Km)酶液与不同浓度L苯丙氨酸反应,利用反应终止法测定酶反应初速度(V),根据Line值[12]。2结果2.1眼镜蛇蛇毒凝胶色谱眼镜蛇毒粗毒经SephadexG100凝胶层析后获得5个蛋白峰,

6、分别标记为Ⅰ~Ⅴ。其中第Ⅱ峰具有LAO活力。从粗毒500mg中可获得Ⅱ组分38.6mg,蛋白回收率约7.8%(图1,表1)。样品:眼镜蛇蛇毒(500mg);凝胶柱:SephadexG1002.6cm×100cm;洗脱液:HAcNaAc缓冲液(0.05mol/L,pH5.8,含0.05mol/LNaCl);流速:16mL/h,4管/h;阴影部分为L氨基酸氧化酶活性组分.图1眼镜蛇蛇毒的SephadexG100凝胶色谱Fig1GelfiltrationofNajaatravenomonSephadexG1002.2LAO纯化凝胶色谱第Ⅱ峰经CM20预装柱POROS20进行分离,分离后可得

7、到7个洗脱峰,其中第4峰具有LAO活力(图2)。合并收集该组分，再次用POROS20纯化,得到A、B两个蛋白峰,经活性测定,其中第B峰具有LAO活性。该组分经SDSPAGE鉴定为电泳纯暂定名为NALAO。从粗毒到获得NALAO各层析步骤的目的组分得率及酶活性变化(表1),NALAO在眼镜蛇毒粗毒中的含量约为0.3％。表1L氨基酸氧化酶的酶活力变化及得率样品:第Ⅱ组分;上样体积:5mL;色