实验九差示分光光度法测定维生素b1片的含量

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1、实验九差示分光光度法测定维生素队片的含量一、实验目的1.掌握差示分光光度法的基本原理。2.熟悉标准曲线定量的操作方法。二、实验原理（一）差示分光光度法（简称AA法），它保留了通常的分光光度法简便、快捷、直接读数的优点，又无需事先分离，并能消除干扰。方法：取两份相等的供试液，分别制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变pH或在其一中加能与供试品发生某种化学反应的试剂），然后将它们稀释至同样浓度后，分置于样品池和参比池中，于适当波长处，测定吸光度的差值（AA）。应用条件：①供试品在不同的化学环境中以不同的分子形式存在，它们的吸收光谱有显著的差异；

2、②干扰物的吸收不受测定时化学环境的影响，光谱行为不变。定量依据：设x、y分别代表在两种不同的化学环境中供试品的存在形式，它们在测定波长处的吸光度以Ax、Ay表示，背景和干扰的吸收度以Az表示，Az不受测定时化学环境改变的影响。根据吸光度加和性原则：△4=4样品一4参比=（AX+4Z）-+4,）==EXCL-EyCL二（Ex-Ey）CL△4ocC鬱即在供试液的一定浓度范围内AA值与其浓度C呈线性关系，并消除了Az的干扰，可用标准曲线法或对照法定量。（二）维生素队片的测定维生素队分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，其紫外吸收随溶液pH的变化而变化。在

3、pH7的磷酸盐缓冲液中具有两个吸收峰，在232〜233nm处，£匕=345;在266nm处，=255。在pH2时，最大吸收在246nni处，£三=425。可用于维生素片的差示分光光度法的测定。三、实验方法（一）测定波长的选择精密称取维生素B^OOmg,用水溶解并稀释成100ml,精密量取2ml二份，分别用缓冲液（pH7.0）和盐酸液（pH2.0）稀释成100ml,以相应溶剂为空白，测定紫外吸收光谱。再将前者放于参比池，后者放于样品池，绘制差示吸收光谱（见图11）。差示光谱图表明在247mn处有最大差示吸收值（AA）,确定247nm为测定波长。（二）标

4、准曲线绘制精密称取干燥至恒重的维生素BdOOing,置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml贮备液各二份，分别置100ml量瓶中，一份用缓冲液稀释至刻度；另一份用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀。取上述五组浓度相同，pH不同的溶液，在247nm处分别测定差示吸收值（AA）。以浓度C为横坐标，以差示吸收值AA为纵坐标绘制标准曲线或进行回归，求得回归方程和相关系数。（三）样品测定取本品20片，精密称定，研细。精密称取适量粉末（约相当于维生素50mg）,置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇

5、匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2ml二份，分别置100ml量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。将前者置参比池中，后者置样品池中，在247nm波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素BP浓度，计算维生素B,片的称不量％。220260300X(nm)图2-11輝生累B,吸收光谱.a.缓冲液（pH7.0）;b.盐酸液（pH2.0）;c.差示光谱本品含维生素B.CCuHnClN^S-HC1）应为标示量的90.0%〜110.0%。xlOO%<^x〒x5O「IFxlOO%计算方法?注意事项1.由于仪器波长可能存在差异，所给测定波长仅供参考，可照

6、“测定波长的选择”项下自行测定。2.测定标准系列各细溶液的AA时，一定要遵循先稀后浓的原则，尽可能消除测定误差。五、思考题1.差示分光光度法的优点是什么？2.差示分光光度法是怎样消除干扰的?