糖尿病kkay小鼠的肝损害

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1、糖尿病KKAy小鼠的肝损害：娄金丽,王谦,杨硕,张锦,郑宏,黄启福【摘要】目的:探讨2型糖尿病肝损害的发生及可能的发病机制。方法:KKAy糖尿病小鼠高脂饮食喂养,28周后处死小鼠,分别取血清和肝组织,全自动生化法检测血糖（GLU）、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)等生化指标;HE、Masson染色观察肝组织病理形态学改变;TUNNEL法检测肝细胞凋亡变化;放免法检测肝组织中IL1β、TNFα含量的变化等。结果:与正常小鼠相比,KKAy糖尿病小鼠血清

2、中GLU、TG、TC均增高（P<0.01）,血清中ALT、AST增高（P<0.01）,肝组织病理形态学检测可见肝细胞呈脂肪变性,肝组织纤维化,并可见肝细胞凋亡;肝组织中IL1β、TNFα含量明显增高（P<0.01）。结论:糖尿病KKAy小鼠存在肝损害;IL1β、TNFα可能是其损伤机制之一。【关键词】2型糖尿病;肝损害;细胞凋亡;细胞因子2型糖尿病是一种以胰岛素抵抗为主的慢性代谢综合征。糖尿病患者由于糖和脂质代谢紊乱,肝内总脂量增多,导致糖尿病与肝病并存。在美国,普通人群

3、中非酒精性脂肪肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD)发生率约为5%,而2型肥胖糖尿病者NAFLD发生率为25%～75%［1］,NAFLD病变进展可由肝细胞脂肪变性发展为肝纤维化、肝硬化、甚至发展为肝功能衰竭或肝癌,故对糖尿病非酒精性脂肪肝的研究日益受到重视［2］。本研究选用KKAy糖尿病小鼠模型,观察了肝损害情况。1材料和方法1.1材料11周龄雄性SPF级KKAy糖尿病小鼠7只（许可证编号:SCXK京2005-0013）,高脂饲料（100g/L脂肪,100g

4、/L蔗糖,基础饲料）,11周龄的雄性清洁级C57BL小鼠7只（许可证编号:SCXK京2002-0003）,C57BL小鼠作为正常组、KKAy小鼠作为模型组。上述小鼠均购自中国医学科学院动物研究所维通利华实验动物中心。125ITNFα、IL1β放射免疫分析试剂盒为北京普尔伟业生物科技有限公司产品;原位细胞凋亡检测试剂盒（Insitucelldeathdetectionkit,POD）为Roche公司产品。1.2方法1.2.1标本采集正常组小鼠喂正常饮食,模型组小鼠喂高脂饮食。饲养期间定期测小鼠的

5、血糖浓度,28周后小鼠禁食12～14h,称重,眼球采血,分离血清,-70℃保存待测。处死动物,取肝组织称重、匀浆、离心、取上清,-70℃保存待测。另取肝组织固定、石蜡包埋、切片。1.2.2血清生化指标的测定采用全自动生化法,检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)及总胆固醇(TC)。1.2.3肝组织病理形态学检测HE,Masson染色,光镜下观察。1.2.4肝细胞凋亡检测TUNNEL法,用蛋白酶K（20mg/L溶于Tris/HCl中,pH7.5）室温孵育30min,滴加50

6、μL的TUNEL反应混和溶液（内含酶浓缩液和标记溶液）,37℃孵育60min,滴加50μL转化剂POD(peroxidase),37℃孵育30min,滴加DAB显色剂,室温下孵育5min,常规脱水、透明、封片,在显微镜观察。在标记时只加入50μL的标记溶液作阴性对照,阳性细胞核呈棕黄色。每张切片随机选取3个高倍视野,采用ImageProPlus5.0软件进行结果分析,用积分光密度（Integratedopticaldensity,IOD）值来表示细胞凋亡的变化。1.2.5放免法测定肝组织中IL

7、1β、TNFα含量新鲜350mg肝组织迅速加入1mL生理盐水匀浆、离心、制备上清后,先做预实验确定样品稀释浓度［3］,然后按照试剂盒说明书中的操作程序进行检测。1.2.6统计学分析所有数据均以x±s表示,用SPSS12.0统计软件进行数据处理。组间比较采用方差分析（OnewayANOVA）。P<0.01为差异有统计学意义。2结果2.1血清各项生化指标的变化模型组与正常组比较空腹血糖含量明显升高（P<0.01）。ALT、AST、TG、TC均高于正常组（P<0.01,表1）。表

8、1血清各项生化指标变化bP<0.01vs正常组.2.2肝脏肉眼观察正常组小鼠肝脏外观呈红褐色,质地软而富有弹性,边缘锐利。模型小鼠肝脏体积明显增大,外观呈灰黄色,边缘圆钝,质地较软,切面油腻感,呈典型肝脂肪变现象。2.3肝组织病理形态学变化HE染色可见正常组小鼠肝组织结构完整,肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列,肝细胞分界清,大小较均一,核圆而清晰,位于细胞中央,胞质丰富,肝窦排列规则,汇管区清晰（图1A）。模型组小鼠肝细胞呈弥漫性脂肪变性,胞质内充满大量大小不等