体外内层血视网膜屏障模型中müller胶质细胞对

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1、体外内层血视网膜屏障模型中Müller胶质细胞对【摘要】建立体外内层血视网膜屏障（iBRB）模型并研究视网膜Müller胶质细胞（RMGC）对紧密连接（TJ）的影响。方法：采用免疫磁珠方法原代纯化和培养大鼠视网膜微血管内皮细胞（RMEC），采用改良酶消化方法培养RMGC，RMEC和RMGC在微孔膜的两侧共培养建立iBRB模型，通过相差显微镜和透射电子显微镜（TEM）观察两种细胞的生长和TJ的形态。采用跨内皮细胞电阻（TER）测量和TJ相关蛋白ZO-1荧光染色和蛋白电泳来评价TJ的变化情况。结果：RMEC和RMGC均可在膜上正常生长，R

2、MGC间紧密连接。TEM观察高TER值样品中相邻RMEC形成典型的TJ结构。RMEC层TER在8d时达到最高，为(86.3±7.9)Ω·cm2，此后保持相对稳定。在RMGC存在的共培养组TER7d时为(97.6±3.6)Ω·cm2，约为7d时RMEC组的2倍，8d达到峰值(113.5±5.3)Ω·cm2。在iBRB模型发展过程中，ZO-1的表达强度随时间延长而增加。结论：通过RMEC和RMGC的共培养可以建立体外iBRB模型，RMGC加快RMEC间的TJ成熟。【关键词】视网膜0引言视网膜为了有效地发挥其功能，需要一个稳定的内环境，这一

3、内环境稳定性的维持依赖于内层血视网膜屏障。内层血视网膜屏障是由视网膜微血管内皮细胞（RMEC）、RMEC间紧密连接（TJ）、基底膜、周细胞、胶质细胞足突和极狭小的细胞外间隙共同组成的一个复合体，是存在于视网膜神经层的血管与神经组织之间的一个动态的调节界面[1-3]。在动物体内许多实验已经得出血视网膜内屏障中，视网膜Müller胶质细胞（RMGC）与RMEC之间存在多种形态和功能学上的联系，但这些因素受到动物个体差异、种群差异及其它神经组织的影响，于是就需要建立一种简化的内层血视网膜屏障（iBRB）的体外模型。我们采用原代培养的RMGC

4、与RMEC建立体外iBRB模型，并研究RMGC对于屏障TJ的作用。1材料和方法1.1材料①RMEC培养及鉴定：选择抗体包被的免疫磁珠，4℃孵育30min，置于磁珠分离装置（MCP-1,Dynal）上用100mL/LFBS洗涤结合磁珠的细胞，将细胞接种于明胶包被的培养板中，加入含75g/L内皮生长添加剂（Sigma）的100mL/L胎牛血清（FBS，杭州四季青）的培养液。细胞培养箱（Heraeus）环境为37℃，50mL/LCO2，950mL/L空气，细胞扩增传代采用2.5g/L胰酶（Gibco）和0.2g/LEDTA（1∶1）混合消化

5、液（TE）。RMEC鉴定采用兔抗大鼠Ⅷ因子抗体（Zymed）免疫组化染色。②RMGC的培养及鉴定：出生2d的EC。RMGC鉴定采用兔抗大鼠GFAP（Dako）和小鼠抗大鼠vimentin（Dako）免疫组化染色。③体内iBRB模型建立方法采用改良Tretiach等[4]和Nakashima等[5]方法，预先使用10g/L明胶包被的聚酯材料、微孔孔径0.4μm、微孔膜面积4.67mm2的Trans2的密度接种于小室外底面，在37℃孵箱中待其大部分贴壁（约2h），翻转置于多孔板孔中，RMEC按照20000/cm2的密度接种于TransL/

6、L戊二醛固定液中，室温下固定1h，冰上固定30min，此时用固定缓冲液清洗3次，每次5min，然后在冰上置于20mL/L锇酸溶液中1h，用固定缓冲液清洗3次，每次5min。然后将滤膜剪成1mm×5mm小条，依次在冰上经过100，300和500mL/L乙醇溶液，每次脱水10min，含20g/L乙酸双氧铀700mL/L乙醇溶液脱水20min，900mL/L和1000mL/L乙醇溶液中脱水，每次10min。用乙醇和CO2临界点干燥。透射电镜标本组织包埋在Epon树脂中，制作超薄切片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色，HitachiH-600透射电子

7、显微镜(Japan)观察并照相。扫描电镜标本固定在一个自制平台上，溅射镀金膜，ElectronicJSM-840扫描电子显微镜(Japan)观察并照相。1.2.2ZO-1免疫荧光染色从小室中剪下RMEC贴附的滤膜材料，在室温下用PBS液清洗，在冰上0.2g/LTritonX-100透化孵育2min，PBS液清洗。室温下37g/L多聚甲醛固定细胞15min，0.5mL/LTritonX-100中孵育5min，用PBS液清洗，封闭血清孵育20min。将滤膜剪成4mm×4mm的小块，RMEC面朝上置于培养皿中，加入ZO-1抗体(SantaC

8、ruz,1∶100)在4℃湿房中孵育过夜。空白对照为用PBS代替ZO-1抗体，阴性对照为用免疫前的兔血清代替ZO-1抗体。PBS液清洗，加入羊源性Cy-3-标记IgG(Dako,1∶200)孵育1h，PBS液清洗3次。置