色素家兔脉络膜新生血管中结缔组织生长因子表达

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1、色素家兔脉络膜新生血管中结缔组织生长因子表达作者：覃冬菊，唐罗生，刘湘平，唐朝珍【摘要】目的：通过激光诱导色素家兔脉络膜新生血管（choroidalneovascularization，V）模型，探讨结缔组织生长因子（connectivetissuegro绿激光光凝兔视网膜后极部，诱发V。术后1，3，4RNA在V中的表达。结果：光凝后1RNA主要表达于V及其附近；光凝后3，4RNA仍明显表达，并有增强的趋势。结论：结缔组织生长因子可能参与了实验性V的发生发展。【关键词】脉络膜新生血管0引言黄斑区脉络膜新生血管(choroidalneovasculariz-ation,V)膜形

2、成是年龄相关性黄斑变性(age-rela-tedmaculardegeneration,AMD)、高度近视眼等眼底病中造成视力丧失的最主要原因。实验诱导和手术切除新生血管膜的组织学和免疫组织化学研究证实多种生长因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TFG-β）等在V形成的促进作用[1-5]。结缔组织生长因子（connectivetissuegroRNA序列为5’-CTGCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCTGGG-3’，合成的探针用地高辛5’末端标记。DAB显色剂等其他分析纯均购自武汉博士德公司。半导体泵浦的倍频Nd：YAG532nm绿激光机（法国Q

3、uantelMedicalSA公司的ViridisTg/kg）和地西泮（2.5mg/kg）麻醉后，丁卡因角膜表面麻醉放置三面镜，用倍频Nd：YAG532nm绿激光机，在视盘下方1～2PD击射20点。激光击射参数：光斑直径50μm，功率0.8；激光反应斑以见到有气泡出现或少量出血,提示Bruch膜被击穿为准，并于激光击射后7，21，28d麻醉动物行眼底彩色照像及FFA检查。于激光击射后不同时间段，用空气栓塞法处死动物，去除眼周软组织，下方标记后置于40g/L的甲醛溶液中固定24h，然后沿赤道部剖开，去除眼前节，取包括视盘及下方的全层眼球壁组织，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，以激光斑

4、为中心制成3μm厚的连续石蜡切片,一张常规HE染色光镜下观察V。选取含V激光斑的石蜡切片常规脱蜡至水。原位杂交方法测定CTGFmRNA的表达：30mL/LH2O2室温处理10min，30mL/L檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化30min，期间0.5mol/LPBS或DEPC水充分洗涤37～40℃进行预杂交4h，吸取多余液体，不洗，然后40～42℃杂交过夜。杂交后30～37℃水温的不同浓度的SSC充分洗涤，再滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，每一步之间用0.5mol/LPBS充分洗涤。最后,显微镜下控制DAB显色时间，苏木素复染，乙醇脱水

5、，二甲苯透明，封片，显微镜下观察照像。步骤按照试剂盒说明进行，阴性对照用预杂交液代替杂交液染色。结果以细胞质内出现黄色或棕黄色为阳性信号。2结果在正常组织中，视网膜脉络膜未见CTGFmRNA表达（图1）。光凝1RNA一部分阳性标记位于V及附近梭形组织，另一部分阳性标记位于血管内皮细胞及神经节细胞层（图3）。随着V发展，CTGFmRNA阳性染色有增强的趋势。图1正常色素家兔视网膜CTGFmRNA阴性表达DAB×400光凝术后1RNA一部分阳性标记于V及附近组织DAB×400；B:另一部分标记于血管内皮细胞及神经节细胞层DAB×200图3V色素家兔视网膜CTGFmRNA3讨论在许

6、多眼底疾病中，V是造成视力丧失的主要原因之一。目前V的确切的病因和发生机制尚不清楚，但一致公认V形成是一个多细胞多因子参与的生物过程，这个过程中除了血管内皮细胞的关键作用外，其他细胞如周细胞、纤维母细胞、巨噬细胞和其他炎症细胞也被发现在控制眼部血管形成中都有重要作用，而且还有大量的血管形成调节剂，包括氧、血管形成因子、抗血管形成因子、细胞外基质、炎症介质等的参与[11]。CTGF属于近年发现的一个新的即刻早期基因家族C（CTGF,Cyr61,nov）的成员。目前发现CTGF在TGF-β信号通路中起重要作用，CTGF是TGF-β部分生物学功能的下游介质，它具有多种生物学功能,如

7、刺激多种细胞增殖、细胞粘附、趋化性、诱导血管生成[6-10]，促进细胞外基质成分产生等，在肺、肾、心肌纤维化、动脉粥样硬化及肿瘤等病变都有高表达[6,7]。有研究表明VEGF可以提高牛视网膜内皮细胞和周细胞CTGFmRNA的表达，呈时间依赖性和剂量依赖性，提出CTGF在视网膜新生血管疾病中有重要作用，可能参与血管形成和组织纤维化[10]。He等[12]分析研究了13例手术剥离AMD的V，并研究了CTGF对脉络膜内皮细胞（CEC）的作用。发现V膜上存在强烈的CTGF蛋白的表达，免疫双标记显示CTGF在RP