罗田甜柿种质资源ｉｓｓｒ分子标记初步鉴定

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1、罗田甜柿种质资源ＩＳＳＲ分子标记初步鉴定程华１，陈小玲１，李琳玲１，程军勇２，邓先珍２，张雪花１，黄兵杰１，程水源１（１．黄冈师范学院生命科学学院／经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北黄冈４３８０００；２．湖北省林业科学研究院，武汉４３００７５）摘要：分别采集湖北省罗田县、麻城市自然分布的２８、８株罗田甜柿（ＤｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉＴｈｕｎｂｃｖ．Ｏｒｉｅｎｔａｌｐｅｒｓｉｍｍｏｎ）古树优系及小涩柿、无核、宝盖、秋焰甜柿优系为研究材料，利用简单重复序列间扩增分子标记（Ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅ

2、ｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）技术对４０个甜柿优系进行初步认证及亲缘关系分析。结果表明：①从２１条ＩＳＳＲ引物中筛选出了９条能够扩增出清晰、稳定条带的引物，９条引物共扩增出１８５条谱带，其中多态性条带有１８５条，多态性条带比率为１００％；②应用ＮＴＳＹＳ２．１０ｅ软件对扩增结果进行非加权组平均法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈａｒｉｔｈｍｅｔｉｃｍｅａｎｓ，ＵＰＧＭＡ）聚类分析，４０个甜柿优系大致被分为两大类，遗传相似系数从０．３９到０．９２；③罗田甜柿古树基因资源丰富，每个基因型都有其

3、独特的指纹图谱，遗传多样性高。罗田甜柿优系间的亲缘关系与地理有一定的相关性，麻城市与罗田县地理位置交界区域的罗田甜柿资源相对集中在Ａ区，其他地理位置采集优系集中在Ｂ区。分析结果可为罗田甜柿种质资源开发、基因资源保存、后期品种审定及鉴别提供理论依据。..关键词：罗田甜柿（ＤｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉＴｈｕｎｂｃｖ．Ｏｒｉｅｎｔａｌｐｅｒｓｉｍｍｏｎ）；简单重复序列间扩增分子标记；种质资源；鉴定中图分类号：Ｓ６６５．２；Ｑ７５；Ｓ６０２．４文献标识码：A：0439－８114（２０15）02－0370-07ＤＯＩ：１０．１４

4、０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１5．02．０29柿（ＤｉｏｓｐｙｒｏｓｋａｋｉＴｈｕｎｂ）是我国五大木本粮油树种之一，其果实、果蒂和叶片富含维生素Ｃ、多糖、碘、单宁等营养成分［１］，可广泛应用于食品、药品、饮料等工业领域。作为世界上惟一自然脱涩的甜柿品种罗田甜柿（Ｄ．ｋａｋｉｃｖ．Ｏｒｉｅｎｔａｌｐｅｒｓｉｍｍｏｎ）在湖北省罗田县已有千余年的栽培历史。现在罗田甜柿是中国地理标志产品，种植面积已发展到０．２４万ｈｍ２，年产甜柿０．６万ｔ，鲜果收入达１．４４亿元，是罗田县极具发展潜力的木本粮油产业

5、之一［２］。柿种内的变异极为丰富，芽变品种多，所以品种间的亲缘关系不明析，严重影响了柿资源的推广、育种亲本的选配和栽培立地条件的选择［３］。由于传统的植物形态鉴定存在时效性较差、容易受到环境与主观因素的影响等特点，难以进一步弄清罗田甜柿种质资源的亲缘关系。因此，利用分子标记技术结合形态鉴定手段是理顺罗田甜柿亲缘关系的有效途径。简单重复序列间扩增（Ｉｎｔｅｒｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）分子标记是类似随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，ＲＡＰＤ）标记的

6、一种聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术［４］，是近几年来在微卫星（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）分子标记基础上发展起来的一种新型分子标记技术［５］；ＩＳＳＲ标记能有效揭示种群内的遗传多样性，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传结构及其多样性程度［６］。然而ＩＳＳＲ技术极易受模板、引物以及Ｔａｑ酶等因素的影响，任何一个因素的改变都可能使扩增产物发生变化。为此需要对甜柿ＩＳＳＲ分子标记的反应体系进行优化，使反应结果更加精准。试验选用ＩＳＳＲ技术探讨了罗田甜柿古老优树种质资源的基本

7、情况，以期能够更快速、准确、简便地鉴定这些古老优树间的亲缘关系，从分子学水平上为罗田甜柿种质资源的收集、鉴定和发展利用提供参考依据。１材料与方法１．１材料１．１．１材料罗田甜柿植物材料为湖北省罗田县不同乡镇的古老优树２８个样品，以麻城市不同乡镇的８个样品作为参照，用罗田县农家品种无核（W）、宝盖（B）、小涩柿（S）、秋焰（Q）为筛选引物提供参考。每个样品随机选取１０～２０片幼嫩叶片，田间采叶后装入做好标记的自封袋中，迅速送到黄冈师范学院经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，于－８０℃冰箱中冷冻保存。材料和编

8、号见表１。１．１．２主要试剂琼脂糖、５×ＴＢＥ缓冲液、２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ购自北京天根生化科技有限公司；ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ试剂、３０％聚丙烯酰胺、过硫酸胺、ＴＥＭＥＤ、硝酸银、氢氧化钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸等购自武汉贝尔生物技术有限公司；ＭａｋｅｒＤＬ２０００购自大连宝生物工程有限公司。１．２方法１．２．１罗田甜柿基因组ＤＮＡ的