蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定

《蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、蚕蛹蛋白氨基酸含量的高效液相色谱法测定作者：金维维，赵钟兴，刘旭辉，罗贞钰，张蕾，韦俏娜，廖丹葵【摘要】目的建立蚕蛹蛋白氨基酸含量的测定方法。方法采用柱前衍生反相高效液相色谱法。结果在给定的色谱条件下，18种氨基酸在35min内获得了较好的分离，在一定浓度范围内，氨基酸的峰面积与浓度的线性相关系数在0.9906～0.9998之间，相对标准偏差为2.02%～5.45%(n=5)。并测定了蚕蛹蛋白中氨基酸的组成和含量。结论该方法准确可靠、重复性好，可用于蚕蛹蛋白中氨基酸含量的测定。【关键词】蚕蛹蛋白;氨基酸;高效液相色谱法　　Abstract：ObjectiveToestablishametho

2、dfordeterminationofaminoacidsinprotEinsofsilk.MethodsAreversed-phasehigh-performanceliquidchromatographicmethodforthedeterminationofaminoacidsixtureof18kindsofaminoacidsin.Theresponseinoacidsethodprecisions(n=5)forthedifferentaminoacidsethod,18kindsofaminoacidsinprotEInofsilkined.ConclusionThemetho

3、disaccurate,reliableandrepeatableforthedeterminationofaminoacidsinproteinsofsilk.　　Key;Aminoacids;HPLC　　蚕蛹(BombyxmoriL.)作为药用在我国有悠久的历史。现代研究表明，蚕蛹具有较高的营养价值，其中蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质，不仅含有人体所需的8种必需氨基酸，且氨基酸配比均衡性好，国内已有厂家将蚕蛹水解制成复合氨基酸产品[1]。因此测定蚕蛹氨基酸组成，对以蚕蛹蛋白为原料进一步开发功能产品具有重要的参考价值。　　目前，对氨基酸的测定除采用氨基酸自动分析仪外[2]，柱前衍生反相高效液相色

4、谱法测定氨基酸的技术也得到了很大的发展，且具有快速灵敏、不需专用仪器等优点[3]。高效液相色谱法分析氨基酸时常用的柱前衍生试剂如OPA(邻苯二甲醛)、DANSYL_Cl(丹磺酰氯)、FMOC(9-芴甲基氯甲酸酯)和PITC(异硫氰酸苯酯)等各有优点和缺陷[4～6]。其中因为OPA衍生步骤简单,反应速度快,剩余试剂不干扰测定,衍生物可用紫外、荧光或电化学检测器检测，故其应用最广，但由于不能和仲氨酸反应，而FMOC能与仲氨酸反应，因此将OPA-FMOC联用可克服两者单独使用时的缺点。本实验以OPA及FMOC为柱前衍生化试剂，利用二极管阵列(DAD)在同一通道用338nm和262nm双波长检测,同

5、时检测样品中的一级和二级氨基酸，建立了蚕蛹蛋白质氨基酸分析的方法。1仪器与试剂　　Agilent1100高效液相色谱仪，配四元泵及真空在线脱气机，美国安捷伦科技有限公司产品;CSF-1型超声波清洗器，上海超声波仪器厂产品;101AS-2型电热恒温干燥箱，上海实验仪器有限公司产品。　　18种氨基酸标准品、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)为进口分装产品;3-巯基丙酸(3-MPA)由AlfaAesar公司，邻苯二甲醛，醋酸钠，三乙胺等为国产分析纯，上海国药试剂有限公司产品;甲醇，乙腈，四氢呋喃为色谱纯，天津四友色谱试剂厂产品。　　2方法　　2.1试剂配制流动相A：20mmol/L醋酸钠缓冲液(含0.

6、5%四氢呋喃及0.3‰三乙胺，pH=10.3)，0.45μm滤膜过滤，备用;流动相B：甲醇;流动相C：乙腈。衍生剂A(OPA试剂)：取270mgOPA试剂，溶于2ml无水乙醇中，加入100μl3-巯基丙酸，0.2mol/L硼酸缓冲液(pH10.8)定容至50ml，4℃避光保存。衍生剂B(FMOC试剂)：取10mgFMOC试剂，乙腈定容至10ml。氨基酸标准溶液：18种氨基酸标准品各25mg，0.1mol/LHCl溶解定容至25ml，摇匀，4℃保存。　　2.2水解称取适量经一次脱脂的蚕蛹(约含蛋白质50mg)于安瓿瓶中，加入6mol/LHCl5ml，抽真空封口，于110℃水解24h，开口后在真

7、空干燥器中去酸，定容至25ml，冷冻保存。因某些氨基酸如色氨酸、组氨酸等在酸性条件下容易被破坏[7]，需另取一定量的样品经6mol/LNaOH于安瓿瓶中真空水解24h，6mol/LHCl中和，定容至25ml，冷冻保存。　　2.3衍生分别取20μl氨基酸标准液和样品水解液置于2ml的Eppendorf管中，加入70μl的衍生剂A和10μl的衍生剂B，振荡2min后，经0.22μm过滤膜过滤后进样。　　2.4色谱