含抗凋亡基因bcl

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1、含抗凋亡基因bcl【摘要】目的：构建并鉴定含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒。方法：将抗凋亡基因bcl-2片段从载体pcDNA3.1中切下，定向插入逆转录病毒载体PLNCX2中，酶切鉴定；脂质体法将重组逆转录病毒转入包装细胞系PT67，G418筛选建立稳定表达bcl-2的细胞株。结果：双酶切鉴定,成功构建重组逆转录病毒载体;重组逆转录病毒转入包装细胞PT67,经G418筛选,形成了抗性克隆,并测得病毒滴度为3×1011cfu/L,提示构建的含鼠bcl-2基因重组逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系成功。结论：含抗凋亡基因bcl-2重组

2、逆转录病毒载体构建成功。【关键词】逆转录病毒载体重组bcl-2基因0引言随着一些常见致盲眼病已有较好的防治措施，难治性或不可治性眼病已成为眼科研究的热点和焦点。难治性眼病主要是指一些累及视网膜的变性性疾病，如遗传性视网膜变性、老年性黄斑变性、视网膜色素上皮细胞（RPE）和锥杆（光感受器）细胞的渐进性变性死亡，迄今尚无防止这些细胞变性死亡的有效方法。我们构建抗凋亡基因bcl-2重组逆转录病毒，将其导入培养的正常的SD大鼠RPE细胞，然后将其显微注射入视网膜色素变性鼠的视网膜下腔，对视网膜变性性疾病基因治疗进行探索性研究，为构建并鉴

3、定bcl-2基因重组逆转录病毒的工作报道如下。1材料和方法1.1材料PLNCX2逆转录病毒载体和包装细胞系PT67为第二军医大学微生物教研室潘卫提供，含鼠bcl-2基因的pcDNA3.1（酶切位点（KPnⅠ+XbaⅠ））由中国科学院细胞生化所刘新垣教授惠赠，质粒提取试剂盒和DNA纯化回收试剂盒均购于上海博彩生物科技有限公司；TOP10F’和DH5α大肠杆菌菌株由微生物教研室提供，以CaCl2方法制成感受态细胞；各种限制性内切酶及pMD18T载体购于TaKaRa宝生工程（大连有限公司）；NIH3T3细胞、脂质体及G418均购自Cl

4、ontech公司；琼脂糖及各种生化制剂购于上海华舜生物工程公司产品。1.2方法①pcDNA3.1（bcl-2）的扩增：将小鼠pcDNA3.1（bcl-2）质粒用CaCL2方法转入大肠杆菌TOP10F′菌株中，LB培养基扩增，碱裂解法提取质粒DNA，并用-T载体后转化到感受器DH5α大肠杆菌中，筛选出含有bcl-2目的基因质粒的菌落，提取酶切鉴定后，命名为pGEM-bcl-2。将所选出含有目的基因质粒的大肠杆菌送上海基康公司进行测序。用限制性内切酶HindⅢ和StuⅠ酶解质粒pGEM-bcl-2，电泳、低融点胶回收小鼠bcl-2D

5、NA片段（0.7kb），溶解于TE中，-20℃保存。逆转录病毒载体PLNCX2，用限制性内切酶HindⅢ和StuⅠ酶切后去磷酸化，pGEM-bcl-2经同样酶切后分离出0.7bpbcl-2全部编码区片段，在T4DNA连接酶的作用下与载体连接、转化，以及用快筛法筛选出基因重组子PLNCX2－bcl-2。转染包装细胞系PT67复苏包装细胞系PT67，在完全培养基（含小牛血清）培养中，在转染前12～24h，将PT67细胞系接种于60mm的培养皿中，当细胞生长至60％～80％融合时，加入预先准备好的转染混合液于37℃，CO2孵育箱中培养

6、24h，其中包括重组逆转录病毒载体质粒100μL和空载体100μL（均为质粒5μg，脂质体30μg，用无血清培养液稀释而成）；次日更换新鲜的完全培养基，于转染72h后，吸出培养基，PBS洗涤细胞2次后重新加入5mL完全培养基，继续培养48h，以提高病毒滴度。将转染后的包装细胞按照1∶20的比例传代于含G418（300）的选择培养基培养3d，更换为G418（400g/L）培养基维持筛选，继续培养2.2结果测序与Genebank一致，证明PCR成功扩增带有HindⅢ和StuⅠ两酶酶切位点的目的基因（图1，2）。PLNCX2－bcl-

7、2重组的表达载体的酶切鉴定见图3。当包装细胞生长至60％～80％融合时，加入转染混合液，约数分钟后可发现许多微小的白色颗粒附着在细胞表面，约4～6h后白色颗粒逐渐进入细胞内部。当细胞培养在含G418的选择培养基时，可见细胞大量死亡，随着时间的推移，活着的细胞即为成功转染的细胞，渐有克隆形成。扩增后测定的最大病毒滴度为3×1011cfu/L。3讨论细胞凋亡是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀（suicide）。因此凋亡由基因控制，故又有人称这种细胞死亡为编程性（程序性）细胞死亡（programmedcelldeath，PC

8、D）。现有资料表明，无论在生理还是在病理状态下的PCD，bcl-2基因都是关键的调控因素，bcl-2基因首先被发现位于第14号和第18号染色体平衡异位部位，并存在于大多数人类滤泡细胞淋巴瘤中[1]。bcl-2是B细胞淋巴瘤或白血病-2基因（B-celllymph