定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能

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1、定点突变去除抗乙酰胆碱受体抗体的补体结合功能【摘要】［目的］制备无补体结合功能的免疫球蛋白样抗乙酰胆碱受体抗体，用于重症肌无力的特异性免疫治疗.［方法］应用定点突变技术，将致病性抗乙酰胆碱受体抗体IgG637的重链CH2区的第322位氨基酸进行K322A突变，获得的突变型抗体IgG637/K322A基因经转化大肠杆菌XL1-Blue进行增殖，测定序列证实为突变序列，转染哺乳类细胞CHO-k1进行表达，其产物经酶联免疫吸附试验检测与补体C1q的结合活性.［结果］突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG637/K322A不能与补体C1q结合，而对照抗体IgG637可与补体结合.［结论］经定点突变，成功地获得

2、了失去补体结合功能的抗乙酰胆碱受体抗体.【关键词】受体，胆碱能；重症肌无力；点突变；补体结合；抗体ABSTRACT:OBJECTIVETodevelopanimmunoglobulin-likeantiacetylcholinereceptor(AChR)antibodyentbindingactivity,munotherapyformyastheniagravis.METHODSApathogenicantiAChRantibodyIgG637,previouslymadeinourlaboratory,utatedinthekeysiteofplementC1qbindingK322Ab

3、ysitedirectedmutagenesistechnology.ThegenesofmutantIgG637/K322AedintoEcoliXL1Blueforcloning,sequencingandfurthermoretransinfectedintomammaliancelllineCHOk1forexpression.TheplementC1q-bindingactivityofexpressedproductsIgG637/K322Ainedinenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)byusingpigantihumanC1qmonocl

4、onalantibody.RESULTSThemutantIgG637/K322AentC1qinELISA,anner.CONCLUSIONTheimmunoglobulinlikeantiAChRantibodyentbindingactivityissuccessfullymadefromapathogenicantiAChRantibodyIgG637bysitedirectedmutagenesis.Keyyastheniagravis;pointmutation;plement-binding;antibodies重症肌无力是由抗乙酰胆碱受体抗体介导的自身免疫病，而致病性抗乙酰胆碱

5、受体抗体多为IgG类抗体，它的2个抗原结合片段（Fab）与神经肌肉接头处突触后膜上相邻的2个乙酰胆碱受体结合，可加快乙酰胆碱受体的内化作用（即抗原调变）；也可通过其可结晶片段（Fc）激活补体的C1q成分，经过级联反应形成C5-C9膜攻击复合体，导致乙酰胆碱受体被破坏，出现肌肉收缩无力等症状［1］.由致病性抗乙酰胆碱受体抗体制备的单链抗体因具有单价结合性，不能引起抗原调变，又因缺乏Fc段而不能激活补体，但仍能与乙酰胆碱受体结合，从而封闭致病性抗体与乙酰胆碱结合，对乙酰胆碱受体具有保护作用，可用于重症肌无力的治疗［2］.但单链抗体分子质量小，稳定性差，在应用前需进行基因工程加工处理，以延长在血中的

6、半寿期.随着分子生物学技术的飞速发展和抗体工程技术的不断进步，使制备大分子质量且稳定的单价抗乙酰胆碱受体抗体成为可能.本研究利用定点突变技术，从完型抗乙酰胆碱受体抗体IgG637制备了不能激活补体的突变型抗乙酰胆碱受体抗体IgG637/K322A，为最终制备出可用于治疗重症肌无力的无补体激活功能的单价抗乙酰胆碱受体抗体提供依据.1材料与方法1.1菌种与试剂大肠杆菌XL1-Blue由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室提供，定点突变试剂盒（QuickChangeXLSite-DirectedMutagenesisKit）为美国Stratagene公司产品，质粒纯化试剂盒为德国Qia

7、gen公司产品，猪抗人C1q单克隆抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪Fab段抗体均为德国RocheMolecularBiochemicals公司产品.1.2pIgG1-637的构建应用PCR技术从载体pb3-Fab637中扩增Fab637基因，克隆至载体pIgG1，构建能在哺乳类细胞表达完型抗体IgG637的重组表达载体pIgG1-637［3］.1.3IgG637重链K322A的PCR定点