《醋酸纤维电泳法》word版

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1、南京大学医学院生化实验报告———————————————————————————醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质一实验目的1.学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法2.学习蛋白质染色的方法3.了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义二实验原理电泳（electrophoresis）法：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极泳动这种现象称为电泳。电泳影响因素：蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的PH、离子强度及电渗等。

2、常见的有：醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等。以醇酸纤维等制成薄膜作为支持体的电泳仪称为薄膜电泳。在一定酸碱度条件下，蛋白质分子由于基团电离而带有一定的电荷，在含有缓冲液的薄膜上，受电场力作用以一定的速度向一定的方向移动。不同的蛋白质分子，由于所带电荷的不同，移动的速度和方向也不同，从而达到分离。这种薄膜对蛋白质样品的吸附作用小，几乎完全消除纸蛋白质电泳中出现的拖尾现象，又因为薄膜的亲属性比较小，它所容纳的缓冲液也少。电泳是的电流大部分是样品在传导，因此具有简单，快速，区带清晰，灵敏度高，易于定量和便于保存的特点。本方法样品用量少，5ug的蛋白质就能得到满意

3、的结果。因此特别适合于病理情况下微量蛋白检测。以广泛用于蛋白质和同工酶的分离分析，也可以用于免疫电泳等方面。蛋白质是两性电解质。在pH值小于其等电点的溶液中，蛋白质为正离子，在电场中向阴极移动；在pH值大于其等电点的溶液中，蛋白质为负离子，在电场中向阳极移动。血清中含有数种蛋白质，它们所具有的可解离基团不同，在同一pH的溶液中，所带净电荷不同，故可利用电泳法将它们分离。5血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等，各种蛋白质由于氨基酸祖坟、立体构象、相对分子质量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。由表可知，血清中5种蛋白质的等电点大部分低于pH值7.0，

4、所以在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向阳极移动。蛋白质名称等电点相对分子质量白蛋白4.8869000α1-球蛋白5.06200000α2-球蛋白5.06300000β-球蛋白5.1290000~150000γ-球蛋白6.85~7.50156000~300000在一定范围内，蛋白质的含量与结合的燃染料量成正比，故可将蛋白质区带剪下，分别用0.4mol/LNaOH溶液浸洗下来，进行比色，测定其相对含量。也可以将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，测定其相对含量。肾病、弥漫性肝损害、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、慢性炎症、妊娠等都可以使白蛋白下降。肾病时α1

5、、α2、β球蛋白升高，γ-球蛋白降低。肝硬化时α2、β-球蛋白降低，而α1、γ-球蛋白升高。三实验器材①醋酸纤维薄膜（2cm×8cm）②常压电泳仪③点样器（盖玻片）④培养皿（染色及漂洗用）⑤粗滤纸⑥玻璃板⑦竹镊子⑧白磁反应板⑨人血清或鸡血清四实验试剂①巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.06mol/L）：称取巴比妥钠（A.R.）12.76克和巴比妥（A.R.）1.66克，溶于蒸馏水水并稀释至1000ml。用pH计校正后使用。5②染色液：氨基黑10B0.25克，甲醇（A.R.）50毫升，冰醋酸（A.R.）10毫升，水40毫升，混匀即可（可重复使用）。③漂洗液：95%甲醇（

6、A.R.）45毫升，冰醋酸（A.R.）5毫升，加蒸馏水50毫升，混匀即可。④透明液：冰乙酸（），无水乙醇（），混匀即可。五实验操作1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两5个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤

7、纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.4—0.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。5．漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次（4-5次）至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。6．透明：配制好透明液，用