动态浊度法定量检测痰热清注射液中细菌内毒素

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1、动态浊度法定量检测痰热清注射液中细菌内毒素【摘要】目的：应用动态浊度法定量检测痰热清注射液中的细菌内毒素。方法：采用中国药典2005年版附录细菌内毒素定量检测法。结果:将痰热清注射液进行1∶80稀释，可排除干扰，回收率在50％～200％，无干扰作用。结论：应用动态浊度法测定痰热清注射液中的细菌内毒素是可行的。【关键词】动态浊度法；痰热清注射液；细菌内毒素；干扰实验痰热清注射液是由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花和连翘制成的中药复方注射剂,临床上用于风温肺热病属痰热阻肺证。本品的质量标准［1］中规定其致热物质检查为热原检查法，该法操作复杂、时间长、费用高。本文通过动态浊度法定量检测痰热清注射液中的细

2、菌内毒素含量，建立痰热清注射液中细菌内毒素定量分析的方法。　　1材料与仪器动态浊度鲎试剂（批号：0411260，0409228，1.25mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号：200610，160Eu/支，中国药品生物制品检定所）；痰热清注射液（批号：050915、050926、051026、051125，10mL/支，新谊医药集团·上海凯宝药业有限公司）；BET32B型细菌内毒素测定仪（天津大学无线电厂）；ZH2型漩涡混合器（天津药典仪器厂）。　　2方法与结果　　2.1细菌内毒素限值的确定［2］人体每小时可以接受的最大内毒素剂量为［5.0EU/(kg·h)×60

3、kg］=300EU/h（人均体重按60kg计算）；按痰热清注射液使用说明书，20mL/次，加入5%葡萄糖注射液500mL，控制滴数在60滴/min内（按每1mL为20滴计算），另葡萄糖注射液的内毒素限量为0.5EU/mL；故痰热清注射液允许带入的内毒素最大限量为［300×(500+20)×20/(60×60)-500×0.5］÷20＝30.8EU/mL。本试验采用30.8EU/mL作为细菌内毒素限值。　　2.2标准曲线的制作及可靠性［3］用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品进行溶解稀释，使其最终内毒素浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312Eu/mL稀释系列。各

4、取0.2mL分别加到预先加有0.1mL动态浊度鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做3支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。结果见表1。表1标准曲线的可靠性试验（略）结果标准曲线为lgT=2.81660.3533lgC，r=0.9928，｜r｜>0.980,标准曲线最低内毒素浓度点λ1＝0.0312Eu/mL，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，标准曲线成立。　　2.3干扰实验　　2.3.1供试品最大稀释倍数计算［3］　　按公式MVD=L·C/λ，L为痰热清注射液细菌内毒素限值，C为100%，λ为标准曲线的最低内

5、毒素浓度0.0312Eu/mL，得最大稀释倍数（MVD）为987倍。　　2.3.2供试品溶液配制及预干扰实验［4］　　将痰热清注射液（批号：050915）用细菌内毒素检查用水依次稀释为1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等比系列稀释液，作为供试品空白管（Ct），记为A液。同时另分别取内毒素标准溶液浓度为2λm（λm为中点浓度0.125Eu/mL）和供试品各等比系列的2倍浓度稀释液，在稀释用试管中等量混合，得到在此稀释倍数下含λm内毒素的供试品溶液，作为供试品阳性管（Cs），记为B液。分别取上述溶液各0.2mL加入预先加有0.1mL动态浊度法鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET32B型

6、细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做2支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。计算回收率，回收率（％）=(Cs-Ct)/λm×100％，结果见表2。表2预干扰实验结果（略）结果可见，阴性对照内毒素小于标准曲线最低内毒素浓度点λ1＝0.0312Eu/mL，阴性合格。供试品等比稀释液中，1∶20稀释液的回收率为216.7%，说明该稀释液对鲎试剂有增强作用。1∶40、1∶80、1∶160稀释液的回收率均在50％～200%之间，符合中国药典规定。1∶80稀释液的回收率接近100％，最接近真实值，在日常检查中，选1∶80稀释液为宜。　　2.3.3干扰实验　　另取3批痰热清注射液，用细菌内毒素检

7、查用水稀释为1∶80稀释液，作为供试品空白管，记为A液。同时分别取内毒素标准溶液浓度为2λm和供试品1∶40稀释液，在稀释用试管中等量混合，得作为供试品阳性管，记为B液。分别取两批鲎试剂进行试验。分别取上述溶液各0.2mL加入预先加有0.1mL动态浊度法鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做2支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。结果见表