钙蛋白酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤的保护作用

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1、钙蛋白酶抑制剂对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用【摘要】目的:研究calpain抑制剂（ALLN）对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:45只雄性SD大鼠随机分为正常灌注组、缺血/再灌注组、ALLN+正常灌注组、ALLN+缺血/再灌注组和二甲亚砜+缺血/再灌注组,分别检测再灌注15min时冠状动脉流出量（CF）和冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，荧光分光光度计测定荧光强度来反映calpain活性，免疫印迹法检测心肌细胞calpain蛋白表达量，用流式细胞仪检测细胞内钙荧光强度和细胞凋亡率，并计算凋亡指数。结果：同缺血/

2、再灌注组相比，ALLN+缺血/再灌注组CF显著增高（P<0.01），LDH漏出量、calpain活性和蛋白表达量、胞内钙荧光强度和细胞凋亡指数均显著降低（P<0.01）。结论:ALLN对离体心脏缺血/再灌注损伤有保护作用,可能与其抑制calpain活性，从而减轻calpain对细胞的损伤，减轻了细胞内钙超载有关。【关键词】钙蛋白酶；缺血再灌注损伤；钙离子；凋亡钙蛋白酶（calpain）是半胱氨酸异源二聚体蛋白酶，广泛存在于包括心脏在内的各种组织细胞中，在体内calpain可被钙离子激活后对特定的底物进行限制性水解，参与了细胞增殖、分化、

3、迁移和细胞信号传导等多种生物学功能［1］。calpain的异常激活则参与了许多神经系统疾病，如神经退行性病、外伤性脑损伤和脊髓损伤等，而对其在心脏病理条件下的作用研究不是很多。本试验利用calpain特异性抑制剂，观察其对离体大鼠心脏缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤的影响，旨在探讨calpain在I/R损伤中作用及可能的机制。1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂和仪器calpain抑制剂(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的二抗、FLU

4、O-3/AMFITC(美国Sigma公司)，SO)+I/R组，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15min，然后停止灌注30min，接着再用K-H液恢复灌注40min。1.2.2乳酸脱氢酶(LDH)和冠状动脉流出量(CF)的测定收集再灌注15min时单位时间内的CF，并应用日立全自动生化分析仪测定冠脉流出液中LDH的漏出量。1.2.3心肌匀浆制备去除心房和右心室，将剩余的心脏组织剪碎后加入10ml·（g组织）-1匀浆液（10mmol·L-1NaHCO3，5mmol·L-1NaN3，15mmol·L-1Tris-HCl，pH6.8），制成匀浆后离心

5、（10919×g，20min），收集上清，分装储存于-70℃，以上操作均在4℃进行，蛋白浓度采用Bradford法测定。1.2.4calpain活性测定我们以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特异性作用底物）与calpain反应释放出AMC的荧光强度来代表不同样品中calpain的活性［2］。取150μl的心肌匀浆液，加入1ml的反应缓冲液（145mmol·L-1NaCl,100mmol·L-1Tris-HCl，pH7.3）37℃水浴箱中振荡10min,再加入150μl的500μmol·L-1的N-Succinyl-Leu

6、-Tyr-AMC，在37℃水浴箱中振荡60min后取1ml加入比色皿，在荧光分光光度计上用波长为360nm的光线激发后，测定在440nm处发射的荧光强度。用已知浓度的AMC作标准曲线，测得的结果以ngAMC·min-1·(mg蛋白)-1表示。1.2.5液（终浓度为5mmol·L-1），混匀后避光37℃振荡30min，去除负载液，用D-Hanks液洗涤3次，流式细胞仪参数设置激发波长488nm，发射波长526nm，每组样品取10000个细胞，以平均荧光强度代表各组细胞内的钙离子浓度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混匀后-20℃保存。(2)凋亡的测

7、定：按照Annexin-Ⅴ-FLUOSStainingKIT使用说明，取30μlAnnexin-Ⅴ染料加入到1.5ml的结合缓冲液中，再加入30μlPI染料，充分混匀。每个细胞样品中加入100μl的混合染料，混匀，避光室温放置15min。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果判定Annexin-Ⅴ-／PI-为正常细胞，Annexin-Ⅴ+／PI-为凋亡细胞，Annexin-Ⅴ+／PI+为坏死细胞。每组样品取10000个细胞，计算Annexin-Ⅴ+／PI-细胞数占总细胞数的百分比作为凋亡指数。1.3统计方法数据以x-±s表示，应用SPSS11．5统计软件

8、分析处理，并采用单因素方差检验(ANOVA)分析组间差异的显著性。若差异有统计学意义时，进一步进行两两比较(SNK法)，P