尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

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1、尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序作者：唐松山，唐治华，李红枝，游娟【摘要】目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列，酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin，经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品，后者通过Edman降解法，测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为：DCSSGiniPROTEANCell电泳槽、MiniTra

2、nsBlot电转移槽和PoA恒流预电泳2h,上样后以200V恒压电泳45min。　　1.3.2可逆性蛋白快速染色用蒸馏水冲洗电泳后凝胶，将胶置于玻璃培养皿中，加染色液50mL,震荡5min。待胶条带显现后，用蒸馏水冲洗2～3min，洗去多余染液。将显色后的胶置于玻璃平板上，以黑色为背景，仔细切割分离亚基胶条。将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25mol/LTrisHCl,0.25mol/LEDTA,pH8.5)脱色20min。条带消失后，用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移。　　1.3.3蛋白回收将含2种亚基的胶条

3、分别放入排阻分子量为10kDa的10mm透析袋的一端，充满透析液，扎紧。将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极，在SDSPAGE电泳缓冲液中120V恒压2h，再反向电泳1min。剪去含胶条一端的透析袋，用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋，回收缓冲液，用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移。　　1.3.4单亚基纯度鉴定采用SDSPAGE电泳(T∶C=15∶3.9)，经考马斯亮蓝R250染色，并用脱色液脱至本底无色。　　1.3.5电转移　　1.3.5.1CAPS电转移缓冲液取200mL的CAPS储存液(CAPS22.13g，加去离

4、子水至900mL，用2mol/LNaOH调pH值至11.0，定容至1L)，加甲醇200mL和去离子水1600mL。　　1.3.5.2取PVDF膜，用甲醇浸泡10s，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。用CAPS缓冲液浸泡过物件按海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵的顺序装好夹层，放入小型电转槽中，在60V恒压条件下，于室温下进行电转移，转移时间为1.5h。　　1.3.5.3取出PVDF膜用去离子水略漂洗，用甲醇浸泡10s，然后进行考马斯亮蓝染色(0.1%考马斯亮蓝R250溶于40%甲醇和1%乙酸)，染色50s。用50

5、%甲醇脱色后，用去离子水充分洗涤，剪下待测序的条带。　　1.4Agacutin亚基的N端氨基酸残基测序　　通过反相HPLC分析和乙腈洗脱，采用Edman降解法测定亚基的N端15个氨基酸残基序列(ProciseRcLC蛋白自动测序仪，AppliedBiosystemsCo.),蛋白测序仪可自动显示测序峰。　　2结果　　2.1Agacutin纯品鉴定　　Agacutin纯品经SDSPAGE电泳鉴定，在16和15kDa处显示相近的2条带(图1)。在该电泳条件下，2μg的上样量显示亚基得到有效分离。　　2.2单亚基鉴定　　A

6、gacutin纯品经SDSPAGE电泳分离，可逆性蛋白快速染色，分别切下含2个亚基的条带，经电泳洗脱亚基单肽链。回收的亚基在SDSPAGE电泳胶上分别显示16和15kDa的单一条带(图2)。　　2.3亚基电转移　　电洗脱回收的2个亚基，经SDSPAGE电泳浓缩为狭窄的条带，电印迹到PVDF膜，经考马斯亮蓝染色和脱色液脱色后，分别显示为单一蛋白条带(图2)。　　2.4亚基测序　　2.4.1对照样品测序结果阳性对照见图3A，阴性对照见图3B。　　2.4.2小亚基测序结果15kDa亚基N端15个氨基酸残基序列为DSSG

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