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1、尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序论文唐松山,唐治华,李红枝,游娟【摘要】目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列,酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin,经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品,后者通过Edman降解法,测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为:DCSSGiniPROTEANCell电泳槽、Min
2、iTransBlot电转移槽和PoA恒流预电泳2h,上样后以200V恒压电泳45min。1.3.2可逆性蛋白快速染色用蒸馏水冲洗电泳后凝胶,将胶置于玻璃培养皿中,加染色液50mL,震荡5min。待胶条带显现后,用蒸馏水冲洗2~3min,洗去多余染液。将显色后的胶置于玻璃平板上,以黑色为背景,仔细切割分离亚基胶条。将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25mol/LTrisHCl,.freelol/LEDTA,pH8.5)脱色20min。条带消失后,用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移。1.3.3蛋白回收将含2
3、种亚基的胶条分别放入排阻分子量为10kDa的10mm透析袋的一端,充满透析液,扎紧。将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极,在SDSPAGE电泳缓冲液中120V恒压2h,再反向电泳1min。剪去含胶条一端的透析袋,用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋,回收缓冲液,用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移。1.3.4单亚基纯度鉴定采用SDSPAGE电泳(T∶C=15∶3.9),经考马斯亮蓝R250染色,并用脱色液脱至本底无色。1.3.5电转移1.3.5.1CAPS电转移缓冲液取200mL的CAPS储存液(CAPS22.13
4、g,加去离子水至900mL,用2mol/LNaOH调pH值至11.0,定容至1L),加甲醇200mL和去离子水1600mL。1.3.5.2取PVDF膜,用甲醇浸泡10s,然后放入CAPS电印迹缓冲液中。用CAPS缓冲液浸泡过物件按海绵-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵的顺序装好夹层,放入小型电转槽中,在60V恒压条件下,于室温下进行电转移,转移时间为1.5h。1.3.5.3取出PVDF膜用去离子水略漂洗,用甲醇浸泡10s,然后进行考马斯亮蓝染色(0.1%考马斯亮蓝R250溶于40%甲醇和1%乙酸),染色5
5、0s。用50%甲醇脱色后,用去离子水充分洗涤,剪下待测序的条带。1.4Agacutin亚基的N端氨基酸残基测序通过反相HPLC分析和乙腈洗脱,采用Edman降解法测定亚基的N端15个氨基酸残基序列(ProciseRcLC蛋白自动测序仪,AppliedBiosystemsCo.),蛋白测序仪可自动显示测序峰。2结果2.1Agacutin纯品鉴定Agacutin纯品经SDSPAGE电泳鉴定,在16和15kDa处显示相近的2条带(图1)。在该电泳条件下,2μg的上样量显示亚基得到有效分离。2.2单亚基鉴定Agac
6、utin纯品经SDSPAGE电泳分离,可逆性蛋白快速染色,分别切下含2个亚基的条带,经电泳洗脱亚基单肽链。回收的亚基在SDSPAGE电泳胶上分别显示16和15kDa的单一条带(图2)。2.3亚基电转移电洗脱回收的2个亚基,经SDSPAGE电泳浓缩为狭窄的条带,电印迹到PVDF膜,经考马斯亮蓝染色和脱色液脱色后,分别显示为单一蛋白条带(图2)。2.4亚基测序2.4.1对照样品测序结果阳性对照见图3A,阴性对照见图3B。2.4.2小亚基测序结果15kDa亚基N端15个氨基酸残基序列为DSSGK,NIULC,
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