尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序

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1、尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶Agacutin的亚基的拆分和氨基酸残基测序：唐松山，唐治华，李红枝，游娟【摘要】目的测定Agacutin两个相近亚基的N端15个氨基酸残基序列，酶分子的2个亚基需拆分以获得亚基单肽链并测序。方法通过生物化学方法获得高纯化Agacutin，经SDS-PAGE电泳分离、亚基胶条回收及PVDF膜电转移技术等方法制备了可供鉴定和测序的单亚基样品，后者通过Edman降解法，测定了亚基N端15个氨基酸残基序列。结果大亚基(16kDa)的序列为：DCSSGinusesoftheclosetandegradationmethodinedtob

2、eDCSSGe.　　Key;thrombin?likeenzyme;subunitseparation;proteinN?terminalsequencing.　　蛇毒含有许多特殊蛋白酶和活性多肽,这些酶可能作为支持物质参与消化，并且也是蛇毒神经毒和出血毒的主要原因。自1995年以来，一系列对血液凝固系统起作用的结构和功能多样性的酶自尖吻蝮蛇蛇毒中被纯化。1995年,ChenYL等[1]纯化了Agkicetin(14和15kDa的异二聚体)，它具有GP1b拮抗剂和血小板抑制活性;1998年,YehCH等[2]纯化了Accutin(5.241kDa)

3、，一个新的整合素成员，它潜在性地抑制血小板聚集;1999年，Huang等[3]报道了类凝血酶Acuthrombin?A(28kDa)和Acuthrombin?C(69kDa);ChengX等[4]纯化了纤维蛋白溶解酶Agkisacutacin(14和15kDa的异二聚体);PanH等[5]成功克隆了Acutin(38kDa)，一个具有去纤化功能的类凝血酶;2000年，XuXL等[6]报道了2个抗凝血类凝血酶ACF?I(AnticoagulationFactor?I)和ACF?Ⅱ(Anticoagulationfactor?Ⅱ)(14.6和14.7k

4、Da的异二聚体);2001年,YehCH等[7]报道了血小板糖蛋白Ib拮抗剂Agkistin(16.5和15.5kDa的异二聚体)和LiangXX等[8]报道了纤溶酶FⅡ(a)(26kDa);2003年，郑颖等[9]纯化了2个类凝血酶;2004年,李婷等[10]纯化了抗凝血功能的类凝血酶(14.4和17kDa的异二聚体);吴忠和苏薇薇报道了具有止血活性的类凝血酶Halase[11,12]。　　自1993年起，本课题组尝试从尖吻蝮蛇蛇毒中分离具有止血功能的类凝血酶。目前，已获得5个以纤维蛋白原为底物的酶，进一步的研究发现，至少有2个酶具有止血活性，A

5、gacutin是被研究的最全面的一个。本文报道了Agacutin的亚基拆分和N端15个氨基酸残基序列测定。　　1材料与方法　　1.1试剂　　聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、TRIS和CAPS{3?[Cyclohexylamino]?1?propane?sulfonicacid}购自Promega公司;PVDF膜为Bio?Rad公司产品;可逆性蛋白质快速染色试剂盒为北京天为时代科技有限公司产品;Agacutin类凝血酶由昆明龙津药业有限公司提供;其余试剂为国产分析纯。　　1.2仪器　　Mini?PROTEANCell电泳槽、MiniTrans?Blot电转移

6、槽和PoA恒流预电泳2h,上样后以200V恒压电泳45min。　　1.3.2可逆性蛋白快速染色用蒸馏水冲洗电泳后凝胶，将胶置于玻璃培养皿中，加染色液50mL,震荡5min。待胶条带显现后，用蒸馏水冲洗2～3min，洗去多余染液。将显色后的胶置于玻璃平板上，以黑色为背景，仔细切割分离亚基胶条。将回收的亚基胶条放入脱色液(0.25mol/LTris?HCl,0.25mol/LEDTA,pH8.5)脱色20min。条带消失后，用蒸馏水冲洗胶条并进行蛋白回收或电转移。　　1.3.3蛋白回收将含2种亚基的胶条分别放入排阻分子量为10kDa的10mm透析袋的一

7、端，充满透析液，扎紧。将含胶条的一端置于水平电泳槽的阴极，在SDS?PAGE电泳缓冲液中120V恒压2h，再反向电泳1min。剪去含胶条一端的透析袋，用缓冲液反复冲洗另一端的透析袋，回收缓冲液，用于鉴定单亚基的纯度或实行电转移。　　1.3.4单亚基纯度鉴定采用SDS?PAGE电泳(T∶C=15∶3.9)，经考马斯亮蓝R?250染色，并用脱色液脱至本底无色。　　1.3.5电转移　　1.3.5.1CAPS电转移缓冲液取200mL的CAPS储存液(CAPS22.13g，加去离子水至900mL，用2mol/LNaOH调pH值至11.0，定容至1L)，加甲醇

8、200mL和去离子水1600mL。　　1.3.5.2取PVDF膜，用甲醇浸泡10s，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。用CA