共同性斜视眼外肌肌酶组织化学研究

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1、共同性斜视眼外肌肌酶组织化学研宄共同性斜视发病率高，危害性大，不仅有碍于外观，给患者心理上造成严重创伤，而且严重影响双眼视觉的形成和发育。本研究分别采用免疫组织化学染色和肌球蛋白三磷酸腺苷酶（mATPase）组织化学染色的方法对共同性斜视患者弱侧眼外肌和正常人眼外肌的收缩蛋白和快慢纤维进行研究，对共同性斜视进行病因学探讨。1材料和方法1.1材料：收集福建医科大学附属第一医院眼科中心2006年1月至2006年11月共12例共同性斜视患者弱侧眼外肌作为实验组，其中内斜视7例，外斜视5例；男性6例，女性6例；年龄最小7岁，最大25岁，平均14岁；于斜视矫正手术中取其缩短的直肌为标本。收集同

2、期无眼肌疾患行眼球摘除的患者6例作为对照组，于手术中取其直肌为标本。所有标本在离体后用显微手术剪剪成2部分，均为4X4X2mm大小，一份立即置于10%甲醛中性固定液中，石蜡包埋，待用；一份速存于液氮速冻后-80°C保存，待用。1.2主要试剂：三磷酸腺苷二钠盐（ATP产地美国，购自上海捷瑞生物工程有限公司）；鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体（购自北京中杉公司）；鼠抗人骨骼肌肌球蛋白单克隆抗体（购自北京中杉公司）；PV9000二步法检测系统（美国GBI公司产品，购自北京中杉公司1.3酸性前孵育肌球蛋白ATP酶染色法：取低温冷冻标本，确定方向，用恒冷冰冻切片机-20°C下做横向连续切片（肌纤维横断

3、面），厚8um;取一份切片置于酸性前孵育液的切片缸中，室温下作用5分钟；置于贮备液中作用3分钟；放入孵育液切片缸，在37°C恒温箱中，作用1小时；取出标本直接置于2%的氯化钻溶液（临时配置）中作用3分钟；流水浸洗5分钟；置于1%的硫化胺溶液（临时配置）中作用30秒；流水浸洗5分钟；待干燥后用国产中性树胶封片。1.4观察方法：光镜下观察mATPase染色和免疫组化染色结果。ATP酶染色在pH值为4.4的酸性前孵育液处理后快肌纤维不着色或染成淡灰色，慢肌纤维染成深黑色。肌动蛋白和肌球蛋白阳性反应为棕黄色颗粒，主要表达于细胞浆，在放大200倍下对热点视野以OLYMPUSBH2显微摄像系统对

4、切片进行摄像，每张切片取5个视野，每个视野取100个肌纤维作形态学图像分析OEDR801D形态学图像分析系统6.0软件，福建医科大学组胚教研室提供），取平均光密度值，数据以“均数标准差”表示。1.5数据统计分析方法：运用SPSS11.5软件包对数据进行处理。组间差异采用成组t检验方法，检验水准a=0.05。2结果对照组切片可见均匀分布不着色或染成淡灰色的快肌纤维（细箭号）以及染成深黑色的慢肌纤维（粗箭号共同性斜视组切片肌纤维明显减少，分布散乱，形态不一，未见群组化现象。（见图1，图2）对12例共同性斜视患者标本和6例对照标本的慢肌纤维及快肌纤维进行光镜观察，随机视野计

5、数500个肌纤维，比较慢肌纤维及快肌纤维的比值，结果以表示，组间差异采用成组t检验。结果在共同性斜视组切片中，可见肌纤维明显减少，而未见群组化现象。而与对照组相比较，共同性斜视组慢肌纤维/快肌纤维的比值无统计学差异（表1）。3讨论当前国内外的基础研究比较多的集中在眼外肌的病理解剖学上。Corsi［l］对先天性斜视患者的眼外肌巩膜肌腱连接处的本体感受器形态学改变进行观察，提出斜视患者眼外肌感受器的信息的接受与传导异常的观点，认为眼外肌本身感受器的异常在先天性斜视发病机制中起重要作用。Domenici-Lombardo等［2］提出斜视最重要的功能变化与巩膜肌腱接头处的病变有关的观点。De

6、-Gottrau等［3］测量25例正常成年人新鲜尸体眼球直肌止端到角膜缘的距离认为眼外肌止端位置的改变可能为发生斜视的解剖学上的相关因素。对于共同性斜视患者眼外肌的组织学研究，如肌酶组织化学和非肌酶组织化学观察等较为少见。本研宄采用免疫组织化学染色和mATPase组织化学染色的方法对共同性斜视病人和正常人眼外肌的收缩蛋白和快慢纤维进行对比研宄。mATPase染色法为区分肌纤维类型的最佳方法，该染色方法对发现肌纤维内部结构变化，区别肌纤维类型，成群肌萎缩以及同型肌群化，鉴别神经源性肌肉疾病和肌肉源性肌肉疾病具有重要价值，常用于各种肌源性肌肉疾病和神经源性肌病的诊断。强直性肌营养不良症和

7、强直性肌营养不良症是一种典型的肌源性肌肉疾病，用肌球蛋白ATP酶染色法对其病变肌肉进行染色可见肌组织纤维大小不等，慢肌纤维萎缩、快型肌纤维肥大，核内移早期出现在萎缩的慢型肌纤维内，随着肌力的减弱核内移明显增加的骨骼肌病理改变；到病变晚期，大多数萎缩纤维和很多肥大纤维含有一个或多个内移的肌纤维核，偶可见环形纤维；肌纤维无明显群组化现象。Vihola等应用肌球蛋白重链免疫组化和酶组化方法对此类肌纤维进行分型研究结果显示I型强直性肌营养不良症患者以II型肌纤维萎