儿童肺炎支原体四种血清学检测方法的比较

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1、儿童肺炎支原体四种血清学检测方法的比较【摘要】目的：通过对儿童肺炎支原体感染不同血清学方法检测的结果比较，评价检测方法对肺炎支原体感染的诊断价值。方法：选用我院儿科住院的肺炎患者395例，分别采用酶联免疫法(ELISA)、金标渗滤法(DIM)检测血清MPAbIgM，荧光定量PCR（FQ－PCR）检测MPDNA和冷凝集试验(CAT)。结果：395例小儿肺炎患者受检样品中,87例2岁以下患儿、124例3岁~6岁患儿、184例7岁~14岁患儿的阳性结果及总阳性率分别为冷凝集试验：17例(19.5%)、36例(29.0%)、62例(33.7%)、29.1%；金标渗滤法：31例(35.6%)、53例

2、(42.7%)、85例(46.2%)、42.8%；酶联免疫法：33例(37.9%)、54例(43.5%)、86例(46.7%)、43.8%；荧光PCR法：35例(40.2%)、57例(47.0%)、88例(47.8%)、45.6%。结论：MPAbIgM是机体受肺炎支原体感染时最早出现的特异性抗体，血清MPAbIgM检测具有操作简便、检出率与PCR法相当、能早期诊断的优点，特别是金标渗滤法，所需时间最短，又不需要特殊仪器，最适用于一般医院开展应用。【关键词】肺炎支原体；血清学；金标渗滤；冷凝集；酶联免疫；荧光定量PCR肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae,MP)无细胞壁，最外

3、层为细胞膜，基本形态呈球形或丝形，长约2μm~5μｍ，革兰染色阴性，其基因组为环状双链DNA。是儿童肺炎和其他呼吸道感染的重要病因之一。近年来，已成为小儿肺炎常见的病原体［1］，由其引起的呼吸感染日趋增多［2］，MP感染可在任何年龄发生，尤其以5岁～20岁更多见［3］。MP通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，感染后引起MP肺炎，每隔3a～5a出现一次地区性流行，占各类肺炎总数的10%～20%，它不但可引起原发性非典型性肺炎，而且可引起全身器官的病变。目前，实验室诊断方法主要依靠血清学。本文对395例小儿肺炎患者进行了冷凝集、酶联免疫法与金标渗滤法查MPAbIgM、荧光定量PCR法检测MPDNA

4、的检测比较，结果如下。　　1材料研究对象为2005年1月至2006年2月在我院儿科住院的肺炎患者395例，男性235例，女性160例，年龄30d~14岁。按年龄分组：2岁以下患儿87例、3岁~6岁患儿124例、7岁~14岁患儿184例。采集静脉血于枸橼酸钠抗凝管1.0ml，普通试管3.5ml。普通试管分离的血清留0.5ml于带盖的子弹头试管，储于-30℃冰箱集中用酶联免疫法检测MP抗体IgM。冷凝集试验、滴金免疫法测定MP抗体IgM于采血当天检测。荧光PCR法采样咽拭子标本，采集时以清晨为宜。用清水漱口，由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，达咽峡部的病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及

5、口腔黏膜等处，将取样的咽拭子放入0.5ml无菌的生理盐水中充分漂洗，然后贴壁挤干丢弃，样本-30℃保存后集中检测。　　2方法　　2.1冷凝集试验　　血清0.5ml用0.85%生理盐水作倍比稀释至第9管,第10管用0.5ml生理盐水作阴性对照管。各加1%红细胞悬液0.5ml，混匀后置4℃冰箱1h。取出后立即观察结果。管底红细胞凝集，轻摇不易散开，再放入37℃水浴箱10min~30min，凝集消失者为真阳性，并以该管的稀释倍数为效价报告，按1∶32以上或双份效价4倍以上变化者为阳性，提示感染。　　2.2金标渗滤法检测　　MPAbIgM试剂盒购自兰波生物技术研究所。于效期内按试剂盒说明书进行操作和

6、判断结果。　　2.3酶联免疫法检测　　MPAbIgM试剂盒购自华美生物技术有限公司，仪器：伯乐1575洗板机、美国宝特EL311S酶标仪。于效期内按试剂盒说明书进行操作和判断结果。　　2.4荧光定量PCR法　　MP核酸扩增荧光检测试剂盒购自深圳市匹基生物工程股份有限公司，仪器：大和LineGene荧光定量PCR检测仪。样本处理：取样本100μl加入100μlDNA提取液，振荡混匀。13000rpm离心15min,吸弃上清液（尽量不碰沉淀物）。加入50μlDNA提取液2，振荡混匀。100℃干浴10min,13000rpm离心10min，保留上清液备用。PCR反应体系：MPPCR反应液35.6

7、μl+Taq酶0.4μl+UNG0.06μl+样品裂解物4μl。循环条件：37℃5min,94℃1min,95℃5s,60℃40s,40个循环，反应体系设40μl。每次试验均有阴性对照与阳性对照；按说明书操作；试剂有效期内使用。　　3结果395例小儿肺炎患者MP四种血清学检测结果，见表1。表1395例小儿肺炎患者MP四种血清学检测结果（略）　　从表1中可看出，荧光PCR法检出率最高，酶联免疫法与金