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《荧光定量PCR技术和原理详细讲解.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、7500Real-TimePCR安装培训ChinaServiceDepartment内容简介内容简介●一、基本原理●二、化学原理●三、技术应用●四、实时定量PCR概述●五、仪器软件（现场演示）一、基本原理一、基本原理什么是什么是RealReal--timePCR?timePCR?实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术Technologytomonitor,inreal-time,thePCRamplificationofspecificnucleicacidtargetsRealReal--ti
2、mePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●和传统PCR一样具有以下基本要素dsDNADNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer缓冲液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGAGTACGGACTGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Real
3、Real--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●在控温模块（TemperatureBlock）上实现循环反应»Denaturatingoftemplate（模板变性）»Annealingofoligos（引物退火）N个cycles»Extensionofprimerstomakenewproducts（序列扩增）RealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●在PCR混合液中含有荧光物质（荧光物质（fluorescencefluorescence
4、））RealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●Real-TimePCR仪包括thermalblock控制温度,halogenlamp激发荧光,filters,和CCDcamera检测信号HalogenlampExcitation/emissionfiltersCCDcameraThermalcyclingblockRealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加PCRPCRPCRp
5、roductLotsofPCRRealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●Real-timePCR仪会纪录每个循环经过每个滤光片的荧光信号变化Cycle1FilterASample1Level:RealReal--timePCRtimePCR是如何实现的是如何实现的??●最后,real-time软件会对采集到的数据进行分析二、化学原理二、化学原理支持的化学试剂支持的化学试剂TaqManTaqMan®SYBRSYBR®GreenIGreenITaqManTaqMan
6、®®化学原理化学原理((又称又称55’’--Nuclease)Nuclease)TaqManTaqMan®中会使用到两段短片段序列中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物，称为双向特异引物第三段短片段序列，又称为探针第三段短片段序列，又称为探针,,位于位于序列中间序列中间探针标记两种探针标记两种染料分子染料分子报告染料淬灭染料ReporterdyeQuencherdye完整的探针完整的探针光(激发)Reporter没有能量荧光信号（发射）然而，如果探针断裂了然而，如果探针断裂了…………光能Taq
7、ManTaqMan®®进行中进行中…………DenaturationDenaturation变性变性(95(95ººC)C)AnnealingAnnealing退火退火(60(60ººC)C)TaqTaq酶登场酶登场…………找到引物序列找到引物序列…………开始延伸开始延伸(60(60ººC)C)ExtensionExtension延伸延伸(60(60ººC)C)ExtensionExtension延伸延伸(60(60ººC)C)ExtensionExtension延伸延伸(60(60ººC)C)?T
8、aq酶很特别……●具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’结合到模板上的DNA片段TaqTaq酶降解探针酶降解探针TaqTaq酶降解探针酶降解探针TaqTaq酶降解探针酶降解探针嗝!每个循环之后每个循环之后●理论上，反应管里的目标片断数会加倍。●报告荧光信号相应成比例增长。RealReal--TimeTime扩增检测扩增检测Fluorescence荧光信号循环数ABI7500TaqManABI7500TaqMan®®荧光染料选择荧光染料选择报告荧光分子:FAM™,VIC®,JOE™,NED
