工程化改造酮古龙酸杆菌强化混菌间的互作关系

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1、工程化改造酮古龙酸杆菌强化混菌间的互作关系TheengineeredKetogulonigeniumvulgareenhancedinteractionwithcompanionBacillusstrain学科专业：制药工程研究生：潘才惠指导教师：丁明珠天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡

2、献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要强化酮古龙酸杆菌(Ketogulonigeniumvulgare)与伴生菌Bacillussp.之间相互作用关

3、系是优化维生素C工业生产的重要研究方向。本文通过工程化改造K.vulgare构建高产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）菌株以促进其与伴生菌之间的相互作用，提高混菌体系发酵水平。一方面，本研究通过表达编码高丝氨酸激酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、组胺醇磷酸酶基因来重构K.vulgare缺失的苏氨酸、脯氨酸、组氨酸生物合成路径。经单菌摇瓶发酵验证，发现表达来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)的高丝氨酸激酶重组菌SyBE_Kv02080002生物量最佳且2-KGA产率提高25.13%；当配合伴生菌内生芽胞杆菌(B

4、.endophyticus)混菌发酵时，发酵周期缩短16.67%；之后在5-L发酵罐中进行混菌发酵时，发酵周期缩短28.57%。同时，我们也在细胞形态和基因表达水平方面探索了重组菌SyBE_Kv02080002高产2-KGA的机理。通过扫描电镜观测，重组菌在细胞形态上变为原来的2倍左右。与此同时，转录水平分析表明重组菌膜上与2-KGA生成相关的酶如山梨酮／艾杜糖酸脱氢酶活性相比原始K.vulgare分别提高3.78倍和1.54倍。另一方面，在K.vulgare中表达来源于G.oxydans的硫辛酸合成模块后发现重组菌产酸能力略优于外源添加硫辛酸

5、，相比原始K.vulgare产酸量提高了5.25%。在5-L发酵罐中进行单菌发酵时，周期缩短5h左右。当配合伴生菌B.endophyticus和B.thuringiensis混菌发酵时，2-KGA的产量分别高于原始混菌体系7.4%和3%左右。通过基因转录分析发现，编码以硫辛酸为辅酶的蛋白如酮酸脱氢酶复合体（E2）亚基和甘氨酸剪切系统（H）的基因在重组菌内的转录水平分别为原始菌株的2.54倍和2.51倍。最后我们通过对两类伴生菌胞外代谢物测定以比较不同伴生菌的伴生作用，发现两类伴生菌分泌的胞外代谢物种类和数量各异，因此与产酸菌K.vulgare配

6、合发酵时，两类伴生菌与K.vulgare相互作用和协助产酸能力不同。关键词：2-酮基-L-古龙酸，酮古龙酸杆菌，苏云金芽孢杆菌，内生芽胞杆菌，混菌发酵IABSTRACTIncreasingtheinteractionbetweenKetogulonigeniumvulgareandcompanionBacillusstrainisanimportantwaytooptimizetheindustrialproductionofVitaminC.Inthisstudy,theinteractionbetweentheengineeredK.vul

7、gareandcompanionBacillusstrainwasenhanced,andthefermentationlevelofthemicrobialconsortiumwasimproved.Firstly,wereconstructedthesyntheticpathwaysofthreonine,prolineandhistineviaexpressingabsentgenesencodinghomoserinekinase,pyroline-5-carboxylatereductaseandhistidinol-phosphat

8、ephosphatase,respectively.Whenmono-culturedinshakeflasks,thestrainSyBE_Kv02