大叶桉炭疽病病原菌的鉴定及室内药剂筛选

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1、大叶桉炭疽病病原菌的鉴定及室内药剂筛选doi：10.13360/j.issn.1000-8101.2015.04.030中图分类号：S763曾学英（四川师范大学，成都610068）摘要：2014年笔者首次在四川攀枝花大叶桉种植区内发现疑似大叶桉炭疽病病害，通过对发病植株病健交界处叶片采样、分离、单孢培养及致病性测定，得到1株具有代表性的菌株Z-D-07，结合形态学以及基于rDNA?ITS序列的系统发育对该菌株的种类进行鉴定。结果表明，该菌株形态学特性与博宁刺盘孢Colletotrichumboninense一致；利用真菌通用引物ITS1和ITS4进行rDN

2、A的扩增，对扩增产物进行回收、克隆、测序，得到597bp的基因片段，通过登陆NCBI进行Blast比对，注册登录号为KJ619456，并建立同源性较高的Colletotrichum属菌株的系统发育树，确定菌株Z-D-07为炭疽菌属胶胞炭疽菌Colletotrichumboninense。分别选用6种常见农药对大叶桉炭疽病菌进行室内药剂防治试验，发现70%代森锰森锰锌防治效果最好，80%炭疽福美次之。.jyqkedanthraxEucalyptusrobustaplantingregionsinPanzhihua，Sichuan，in2014.D18-T）连

3、接后转入到感受态大肠杆菌内，最后选取阳性克隆产物送至生物公司进行测序。1.4.4ITS序列分析及系统发育树的构建根据生物公司发回的片段序列，登陆NCBI进行Blast比对，从GeneBank中下载同源性较高菌株的rDNA-ITS序列，利用MEGA5.0建立菌株Z-D-07的系统发育树，进行基于rDNA-ITS的序列分析。1.5室内药剂筛选大叶桉炭疽病病原菌抑菌药剂筛选试验参照黄祖旬等［16］的方法，略有改动。选取甲基硫菌灵，70%代森锰锌，80%炭疽福美，75%百菌清，50%多菌灵，50%异菌脲，分别稀释成500，800，1000，1500倍液，各取2mL

4、添加到含有PDA培养基的平板中（直径为90mm），然后接种Z-D-07菌饼，25℃，pH7条件下培养7d后测定菌落直径，同时接种不添加药剂平板作空白对照。2结果与分析2.1大叶桉炭疽病的发生情况采用“Z”字抽样的方法对攀枝花大叶桉1号种植区内病害调查结果显示，受到病原菌侵染的大叶桉叶片与大叶桉焦枯病发病症状类似，从叶部边缘开始出现颜色改变的症状，侵染初期，叶片边缘出现淡黄色至浅褐色不等程度的圆斑，并伴有红色环状圈，随着病情加重，叶片出现形变，甚至枯萎的症状，湿润环境下，叶片背面会出现红色或红褐色的孢子堆。根据提前制定的大叶桉炭疽病分级标准，5个等级均有不同

5、程度的发生（表1），其中以1，2，3等级发生较为普遍，4，5等级较少，虽然健康植株所占比例较高，达到36.58%，但各等级感病指数总计达到30.70，由此可知该地区大叶桉炭疽病的发生较为严重。2.2病原菌的分离、培养及致病性通过常规组织分离法对100个发病样品进行病原菌的分离，25℃，pH7条件下于PDA培养基上培养5～7d后，得到58株白色至灰白色圆形优势菌落，其形态学一致，故将其标记为优势菌株Z-D-07。将优势菌株Z-D-07制备的孢子悬浮液回接到室内水培1年生大叶桉枝条叶片15d后，与图3对照健康叶片相比，几乎全部人工接种的叶片均出现不同程度的感病

6、情况，且其感病症状与从攀枝花大叶桉种植园区的发病植株的叶片症状完全一致，均出现不同程度的红色圆斑，并伴有红色环状圈（图1），说明该优势菌株是引起园区内大叶桉叶部病害的病原菌。但室内接种（人工诱发）的感病症状与自然发病相比，其发病面积较小，感病指数略低，这可能是由于室内环境相对于自然环境更稳定，受到干扰因素更少，因此其发病症状没有自然条件下明显，而自然条件下的多方面因素（风、雨、温度、湿度、其他病原菌等）干扰也可能成为大叶桉炭疽病大面积发生的潜在致病条件。2.3病原菌的形态学特征将拟确定的优势菌株Z-D-07接种到含PDA的平板上，25℃，pH7条件下培养5

7、～7d后，观察到有橘黄色圆形菌落长出，菌落边缘整齐，菌丝稀疏，白色，后期形成大量子囊壳。待菌落产生分生孢子后，取样制成玻片，显微镜下观察到分生孢子盘生于寄主表皮下，暗褐色，无刚毛；产孢细胞单胞，无色，圆柱形或哑铃形，大小为（8.0～18.0）μm×（4.0～6.5）μm；分生孢子单胞无色，圆柱形，多数一端钝圆，一端稍尖，具脐点。优势菌株Z-D-07的形态学特性与Mills等［17］、Osorio等［18］、Guo等［19］的研究结论一致，因此初步判定该病原菌为大叶桉炭疽病的病原菌Colletotrichumboninense。2.4基于rDNA-ITS序列

8、的分子生物学鉴定结果在初步依据形态学鉴定的基础上，利用真菌通用引物