病原菌分离培养总结

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1、病原菌的分离培养方法一、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。二

2、.病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1.分离的准备工作（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。（2）培养基的准备：PDA培养基，加热熔化，紫外火菌后倒板；（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲（针）、70%酒精、0.1%升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。2.组织分离法（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70%洒精檫拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说

3、话。（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不耍在移动，保证火焰周围无菌环境；（3）取花生褐斑病的症状典型病叶（或其他分离材料），选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块病组织数块。（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐牛.菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。）(4)表面消毒：用菌培养皿一次准备流程(75%酒精一0.1%升汞一无菌水一无菌水一无菌水)，将病组织放人70%酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0.1%升汞液屮分别表面消毒1m

4、in左右(如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些)，然后放入火菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。(4)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。(在将病组织小块移放到平板表而之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染)。(5)将培养皿倒置放人25°C左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均K:出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。(6)除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否R标菌外，还要在显微镜卜检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定：(7)在无菌条

5、件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25°C左右恒温箱内培养，数円后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可保存。二.病原细菌的分离培养(萝卜黑腐病为例)1.分离的准备工作(1)分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。主耍危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变"V"字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射

6、线状、黑褐色；重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同。(2)培养基的准备:PDA，后划线纯化NB;(3)分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70%洒精、洒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。2.黑腐病菌分离(1)工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70%酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。(1)酒精灯放入屮间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；(2)取萝卜黑腐病块茎，用75%酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块

7、(2mm*3nun)，用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。(在将病组织小块移放到平板表而之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染)。(3)将培养皿倒置放人28°C左右恒温箱内培养。一般3—4(1后观察待分离菌生讼结果；若病组织小块上均K:出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。(4)根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落(黄、红、生防)，分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28°C左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即

8、表明己获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。(5)观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹