常见病原菌分离方法

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时间:2018-07-25

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1、常用的几种典型的病原菌分离方法1.斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3~5mm的小块组织,在70%酒精中浸数秒钟后,移入0.1%的升汞水溶液中处理3~5min,以灭菌水冲洗3次,移置培养皿的培养基中,然后培养。2.维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70%酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌的解剖刀削去,然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后。,用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上。3.根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离,由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法,材

2、料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。4.肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等,可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待出现症状后,用此法再行分离。5.种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉),用灭菌水洗涤后,移置培养基上。6.孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法

3、是将土壤取出少许,配制成悬浮液,然后用稀释法或划线法分离。附录2真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理,掌握简便实用的单孢分离方法。二、基本原理单孢分离的方法很多,如振落法、稀释法和直接挑取法。振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法,使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上,然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子,一旦找到理想的单个孢子,就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上,置适温下培养,形成的菌落即为单孢系菌株。直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯

4、化的方法。三、材料、用具与仪器1.材料(依本地资源情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolariaoryzae)。(2)玉米大斑病叶(Exserohilumturcicum)。(3)玉米小斑病叶(Bipolarismaydis)。(4)玉米弯孢菌叶斑病叶(Curtrularialunata)。2.培养基PDA斜面培养基、水琼脂培养基。3.仪器与用品超净工作台、培养箱、无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、镊子、接种针(铲)、接种环、70%酒精、酒精灯、记号笔、橡皮筋套、电炉、铝

5、锅等。四、实验操作(一)利用震落法进行单孢分离(1)用无菌操作将熔化后冷却到60~70℃的水琼脂培养基约10ml倒入灭菌培养皿内,凝固成平板备用。(2)按无菌操作要领,将盛水琼脂平板的培养皿盖打开30~45°角度,将长有较多孢子的植物病组织材料(要事先干燥好,以使孢子易被振落)伸进到水琼脂平板上边轻轻振动,使孢子稀疏地落到平板表面,振落时宁轻勿重,以防过多孢子落于水琼脂平板表面。提示:振动方法可用接种针(铲)灭菌后伸入到生有较多孢子的病组织材料上边轻轻敲击材料。(3)将水琼脂平板翻转后置于显微镜载物台上,用低倍镜(

6、10×10)寻找平板表面上的单个孢子。找到以后用笔在孢子所在视野处的培养皿外表面上,点涂一个圆点作为标志。提示:可以将培养皿放入温箱中(25℃左右)培养10余小时后,待多数孢子开始萌发时再进行检查,这时较易观察,且可以保证孢子具有萌发和生长能力。(4)将水琼脂平板从载物台上取下,按无菌操作要领用接种针将标志好的单孢(连同少量水琼脂)移植到PDA斜面培养基上,用记号笔写好分离者姓名、日期、分离菌,再置于25℃恒温箱培养。(5)数日后如果斜面培养基上生出菌丝,并形成孢子,经镜检此孢子正是我们要分离的目标菌产生的,则此菌

7、种即是经单孢分离获得的纯菌株。(二)利用稀释法进行单孢分离(1)用灭菌水配制孢子悬浮液,稀释到一滴孢子悬浮液中有20~30个左右孢子时,用无菌吸管取一滴孢子悬浮液滴入到灭菌培养皿中(同时也可加入25%乳酸1~2滴)。(2)将已熔化好并冷却到45~50℃的水琼脂培养基约10ml倒入上述灭菌培养皿中摇匀,凝成平板。则上述孢子可分散在此水琼脂平板培养基中。(3)以振落法相同步骤操作,即可获得单孢系菌种。(三)利用直接挑取法进行单孢分离(1)、挑孢针的制作。把直径为3~4mm,长约15cm的玻璃棒一端在酒精灯上烧熔,将一个

8、4号昆虫针尾部插入,把针尖部2mm左右弯折90°而成。提示:用金属材料制作的挑孢针灭菌容易,不易碰碎,可以长期使用。(2)把玉米大斑病病叶置于解剖镜下,寻找目标孢子。可以先在低放大倍率(1×10)下寻找,在高放大倍率(4×10)下,观察是否为单个孢子。(3)找到分生孢子后,将挑孢针在酒精灯上高温灭菌,待稍冷却,用挑孢针把孢子粘上,在酒精等火焰上方移入试管斜面

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