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1、HPLC法测定清开灵注射液中猪去氧胆酸的含量【摘要】目的建立清开灵注射液中猪去氧胆酸的含量测定方法。方法采用HPLC法,色谱柱为UltimateXB-C18(5μm,250mm×4.6mm),流动相为乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.1),流速为1mL/min,柱温为40℃,检测波长为192nm。结果猪去氧胆酸在0.20135～1.00675mg/mL范围内线性关系良好,r＝0.9996,平均加样回收率为98.25%,RSD＝1.26%。结论方法准确、可靠,重复性好,可用于清开灵注射液的质量控制。【关键词】高效液相色谱法；清开灵注射液；猪去氧胆酸Abstract：Objecti
2、veToestablishamethodforcontentdeterminationofhyodeoxycholicacidinQingkailingInjection.MethodsAnUltimateXB-C18column(5μm,250mm×4.6mm)obilephaseofacetonitril-L/min.Thetemperatureofthecolumn.ResultsThereg/mL,r＝0.9996.Theaveragerecoveryethoda,纯度98%)；清开灵注射液(市售样品3批,10mL/支,吉林省集安益盛药业股份有限公司生产)。乙腈为色谱
3、纯,其余所用试剂均为分析纯。 2方法与结果 2.1色谱条件 参考2005版《中华人民共和国药典》(一部)清开灵注射液中胆酸含量测定的色谱条件[2]。经比较色谱峰分离情况以及分离度,确定的色谱条件为色谱柱UltimateXB-C18(5μm,250mm×4.6mm),流动相为乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.1),流速为1mL/min,柱温为40℃,检测波长为192nm。 2.2溶液制备 2.2.1对照品溶液的制备 精密称取猪去氧胆酸对照品适量,加60%乙腈制成每1mL含2.0135mg的溶液,作为对照品溶液。 2.2.2供试品溶液的制备 精密量取本品10mL
4、,加稀盐酸0.5mL,用醋酸乙酯提取4次(20、20、15、15mL),合并醋酸乙酯液,蒸干,残渣加60%乙腈适量使溶解,并转移至25mL量瓶中,用60%乙腈稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm)滤过,取续滤液,即得。 2.2.3阴性溶液的制备 取缺胆酸、猪去氧胆酸的阴性制剂,按供试液溶液制备方法制备,即得。 2.3专属性试验 分别吸取猪去氧胆酸对照品溶液、供试品溶液与阴性溶液,按上述色谱条件进行检测,结果供试品、猪去氧胆酸对照品在相应时间出现猪去氧胆酸特征吸收峰,阴性溶液无干扰吸收峰。结果见图1。 2.4标准曲线及线性范围 分别精密吸取猪去氧胆酸对照品溶液
5、1、2、3、4、5mL,加60%乙腈稀释至10mL,在上述色谱条件下,进样10μL,测定峰面积值。以峰面积平均值和对照品溶液浓度进行回归处理,回归方程为：A＝5.75510×105C－2.114200×103,r＝0.9996；猪去氧胆酸在0.20135～1.00675mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。 2.5最低检测限 取0.20135mg/mL的对照品溶液用60%乙腈稀释1倍,得0.101675mg/mL的溶液,取10μL进样测定,S/N＝3,故最低检测限为1μg。 2.6精密度试验取浓度为0.60405mg/mL对照品溶液10μL进样测定,连续6次,结果
6、RSD＝1.6%。 2.7重复性试验取清开灵注射液样品,按照“2.2.2”项下方法制备供试液,平行试验6份,测定猪去氧胆酸的含量,结果RSD＝2.4%。 2.8稳定性试验取供试品溶液,每隔2.0h进样10μL,测定猪去氧胆酸12h内的峰面积值,结果RSD＝2.8%。 2.9加样回收率试验精密称取猪去氧胆酸对照品,配制成浓度为2.0135mg/mL对照品溶液。另取清开灵注射液(批号060102)5mL,平行试验9份,分别加入对照品溶液,按上述色谱条件测定,结果见表1。表1加样回收率试验结果(略) 2.10样品含量测定取本品3批(批号分别为060101、060102、06
7、0103),按供试品溶液制备方法制备供试液,测定猪去氧胆酸的含量,结果见表2。表23批样品中猪去氧胆酸的含量测定结果(略) 3讨论醋酸乙酯振摇提取次数对猪去氧胆酸提取有一定影响,经试验考察,振摇提取3次可提取98%,提取4次可提取完全,结果与《中华人民共和国药典》中胆酸的提取相一致。 经试验,在上述色谱条件下,胆酸与猪去氧胆酸的分离度为3.7,可完全分离,因此,可同时测定这两个成分,更利于清开灵注射液的质量控制。本试验胆酸、猪去氧胆酸的含量测定方法均与药典中胆酸含量测定方法一致,考虑到胆酸含量测定方
