dbs13004—2016创伤弧菌检验

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1、DBS13河北省地方标准DBS13/004—2016食品安全地方标准创伤弧菌检验（征求意见稿）河北省卫生和计划生育委员会发布2016-××-××实施2016-××-××发布附件1DBS13/004—2016前   言本标准附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2016年××月××日首次发布。3DBS13/004—2016食品安全地方标准创伤弧菌检验1范围本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibriovulnificus）的检验方法。本标准适用于水产品中创伤弧菌的检验。2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±

2、1℃、39.5℃±0.5℃；2.2冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃；2.3恒温水浴箱：45℃±1℃；2.4均质器或无菌乳钵；2.5天平：感量0.1g；2.6无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm；2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；2.8无菌锥形瓶：容量250mL、500mL、1000mL；2.9无菌培养皿：直径90mm；2.10无菌手术剪、镊子等；2.11全自动微生物生化鉴定系统。3培养基和试剂3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。3.2改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂：见附录A中A.

3、2。3.3纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂：见附录A中A.3。3.43％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.4。3.53％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.5。3.6嗜盐性试验培养基：见附录A中A.6。3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。3DBS13/004—20163.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。3.10氧化酶试剂：见附录A中A.10。3.11革兰氏染色液：见附录A中A.11。3.12邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：见附录A中A.12。3.13Voges-Proskauer（V-P）试剂：见

4、附录A中A.13。3.14生化鉴定试剂盒。4检验程序创伤弧菌检验程序见图１。样品25g（mL）+225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水36℃±1℃，18h～24hmCPC或CC平板39℃～40℃，18h～24h挑取可疑菌落，接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂36℃±1℃，18h～24h筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3%氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统结果报告图1创伤弧菌检验程序5操作步骤5.1样品制备5.1.1非冷冻样品采集后应立即置7℃～10℃冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻。3

5、DBS13/004—20165.1.2鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液。甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。5.1.3以无菌操作取样品25g（mL），加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或拍击式均质器拍击1min～2min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225mL3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样

6、品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。5.2增菌将上述1:10样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。5.3分离5.3.1对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于mCPC或CC平板上划线分离。于39℃～40℃培养18h～24h。5.3.2典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈圆形、扁平、中心不透明边缘透明的黄色菌落，直径1mm～2mm。5.4纯培养挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃±1℃培养18h

7、～24h。5.5初步鉴定5.5.1氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。5.5.2涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。5.5.3挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36℃±1℃培养24h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄。5.5.4嗜盐性试验：挑