对外周血y染色体azf微缺失基因检测

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1、对外周血Y染色体AZF微缺失基因检测　　不育不孕症严重影响到一个家庭的和睦及幸福，随着科技及化工业的发展，不育不孕症患者越来越多，成为本世纪严重危害人类生殖健康的疾病之一。　　　　据世界卫生组织（iafactor，AZF）区微缺失被认为是最重要的非梗阻性无精及少精症因素之一，现代分子生物学和细胞遗传学的研究亦证实了与精子生成相关的AZF基因存在于Y染色体长臂q11区，目前将Y染色体AZF区分为4个区位，分别为：AZFa区、AZFb区、AZFc区和AZFd区，其中任何一个区域座位点的微缺失都可导致生精障碍，造成少精或无精而导致男性不育，其微缺失引起的男性不育发

2、生率仅次于Klinefelter综合征，并且在进行辅助生殖技术卵胞质内单精子注射（ICSI）过程中能将这种遗传缺陷传递给男性下一代，因此在进行ICSI治疗之前进行Y染色体微缺失检测具有重要的临床及理论意义。　　　　本研究对来我院诊治的332例男性精子异常患者及100名已育男性进行外周血Y染色体AZF微缺失基因检测，现总结分析报告如下。　　　　1资料与方法　　　　1.1临床资料　　　　病例组：选择2011年7月至2014年1月到我院生殖中心诊治的不育男性患者（年龄20～46岁），诊断标准：女方检查正常，结婚1年以上，未采取避孕措施且夫妻生活正常的情况下不能生育

3、的非阻塞性男性患者，在排除了其他原因如感染等原因后对其进行精液常规分析，按照es;106/mL者为少精症患者；患者每间隔7~14d留取精液检测1次，连续3次未发现精子，进一步离心沉淀也没有发现精子者为无精症患者。对精液分析为异常的患者进行Y染色体AZF微缺失基因检测；阴性对照：健康女性作为阴性对照；健康对照组：100名精子密度>20106/mL的已婚男性（年龄20～46岁）为健康对照组。　　　　1.2研究方法　　　　1.2.1研究对象的DNA抽提：用含乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）抗凝剂的真空管抽取受试者外周血2mL并充分混匀。提取白细胞DNA的

4、试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司提供的全血DNA快速提取试剂盒。　　　　1.2.2多重聚合酶链反应（PCR）扩增检测：用深圳亚能生物技术有限公司提供的Y染色体微缺失检测试剂盒，同时检测Y染色体AZF区域内的以下15个STS序列标鉴位点（sequencetagsite，STS），包括AZFa区：SY82，SY84，SY86；AZFb区：SY124，SY127，SY143，SY134，SY128，SY133；AZFc区：SY254，SY255，SY242，SY239；AZFd区：SY152，SY145。15个序列标鉴位点分成紫、白、蓝、黄4管扩增，详细每管检测位

5、点及排列位置见表1。每管包括14μLPCR反应液，10μL去离子水，1μL待测样本DNA，总体积共25μL。　　　　设定的扩增程序分为3个步骤：第1个为步骤为50℃10min，95℃15min；第2个为步骤为94℃30s，58℃60s，72℃60s共34个循环；第3个步骤为72℃10min。内控对照为Y染色体性别决定区SRY基因，每次实验均以已育健康男性基因组DNA作为阳性对照，健康女性基因组DNA作为阴性对照。　　　　1.2.3电泳检测：吸取PCR扩增后产物6μL。点样于事先配制好的2%Bio，电泳4~5min使DNA迁移出上

6、样孔，再将电压调降到5V/cm电泳30~40min，取出琼脂糖凝胶在凝胶成像系统观察电泳结果。　　　　1.2.4结果判读：Ⅰ管，Ⅱ管，Ⅲ管，Ⅳ管分别为健康男性的DNA提取物分别加入紫、白、蓝、黄4管，Y染色体微缺失检测正常（见图1）PCR电泳对照结果显示，检测者AZFc+AZFd区缺失，缺失位点分别是SY152、SY239、SY242、SY254、SY255（见图2）。　　　　1.3统计学处理　　　　计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。　　　　2结果　　　　Y染色体微缺失检测结果：经多重PCR扩增后电泳结果，100名健康对照

7、组男性组未见Y染色体AZF区微缺失，健康女性对照组未见电泳区带。332例不育男性患者中共检出28例Y染色体AZF区微缺失，AZF微缺失率为8.4%。　　　　180例少精子症患者中检出16例Y染色体AZF区微缺失，AZF微缺失率为8.9%。152例无精子症患者中检出12例Y染色体AZF区微缺失，AZF微缺失率为7.9%；无精子症患者和严重少精子症患者的Y染色体AZF区微缺失率差异无统计学意义（P>0.05）。100名已育健康男性组与不育男性组Y染色体AZF微缺失（8.4%）比较差异有统计学意义（P<0.01）。　　　　男性不育症患者Y染色体微缺失情

8、况：AZFb区3例，占10.7%；AZFc区15例，