细胞生物实验指导

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1、细胞生物实验指导内蒙古大学生命科学学院细胞生物学实验指导目录一、几种光学显微镜的使用二、细胞大小的形态观察——测微尺的使用三、细胞膜的通透性四、胞间连丝观察五、荧光的细胞化学测定六、细胞活力的鉴别七、细胞活体染色技术八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离九、植物原生质体的分离和融合十、植物细胞骨架光学显微观察H^一、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应十二、细胞电泳实验一几种光学显微镜的使用一、实验口的丫解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。二、实验原理

2、（一）基本原理一般实验室经常使川的光学显微镜都是由物镜、n镜、聚光器和光源组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下：AB物体.A3,第一次成像，A2B2第二次成像，OiFI镜.02物镜，F,为0,的前焦点，F2为02的前焦点各种光学显微镜的光学放大原理基本相M）,各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方側作了改动，或在其它方谢增设了某些特殊的设备。（二）几种光学显微镜1.普通光学显微镜：普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般凼定的，有色的透明度较高的标木。M:最人分辨力一•

3、般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。2.喑视野显微镜：暗视對显微错惡以丁达尔现象（Tyndallphenomenon）（即光的微粒散射现象）为基础设计的，它使川了特殊的聚光器进行斜射照明，因光源中心朿不直入物镜，所以视野黑喑，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可川增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0.2-0.004微米直径的微小粒子，但它分不淸被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。喑视野显微镜与普通光学丛微镜的区别，主要在于聚光器的不M，致使照明方

4、法有别。确切地说，称喑视野丛微镜为暗视野照明更为贴切，它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜，使视野背景喑黑，样品明亮的照明方法。1.相差显微镜：相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化井产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。一般凼于被检物体（如不染色的细胞）所能产屮的相差的差别太小，我们的眼晴是很难分辨出这种差别的，只有在变相差为振幅差（明暗之差）之后，才能被分辨。相差显微镜是以光的干涉现象为基础设计的。与普通光学显微镜比较，它在聚光器和物镜上作了改动。用装有环状光栏的聚光器造成的空心光

5、线柱，使直射光（背景）和衍射光（样品）分开。同吋在物镜的f焦血上装柯相位板，使良射光和衍射光发生干涉，从而把我们吻眼不能见的相位差变为可见的振幅差，同时相位板上装杏吸收胶，吸收部分直射（或衍射）光以增加反差，使人们能够看清更加细微的结构。所以相差显微镜一般用于观察活细胞的细微结构。2.荧光显微镜：災光是指某些物质经波长较短的光线照射分了•被激活吸收能虽后呈激发态，其能景除部分转化为热景或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。災光显微镜是以紫外线（3650A）或

6、蓝紫光（4200A）照射某些物质，町激发其产生荧光的原理为基础设计的，利用一个高发光效率的光源，经过一个滤光系统得到紫外光（或蓝紫外光），且接照射标本中的自然荧光物质，使其产生自发荧光，再加以镜检。或以荧光染料先对标木进行染色,然P使之在上述光源照射下产生次生荧光,冉加以镜检。这种显微镜主要用于观察荧光（或次生荧光）物质在细胞内分布情况，以及测定细胞器的生理活性。（三）如何提高分辨力显微镜的能力是质景和性能的标志。能力包括分辨率、放人率、焦点深度和视场宽度等。其中最重要的是分辨率。各种能力都有一定的界限，既互相作用，

7、乂互相制约。改善和提高了某种能力，同时降低了某些能力，只能顾其主要，兼顾其他，综合统筹。1•数片孔後（numerialaperture）数八孔径（N.A.）也叫镜口率，是物镜和被检样品之间的介质的折射率（n）与物镜所接受的光锥顶角（亦称孔径角）的一半《（半孔径角）正弦的乘积。其公式如hN.A.=n•sina物镜的数值孔径愈大，显微镜的能力愈强，数值孔径与分辨率成正比，与焦点深度成反比。物镜的数值孔径的N.A.值刻在物镜壳上，如40/0.65表示40倍的物镜，数值孔径为0.65。物镜的数值孔径随前透镜直径的减少而增人。

8、显微镜物镜的前透镜U径愈小，数值孔径愈大，放大倍数愈高，价格愈高。2.分辨率(resolvingpower)物镜分辨率是指分辨被检样品细微结构的能力。通常以能淸晰地分辨两个物体点的最短距离來表示。其公式如不：R=0.61X入/N.A.R：分辨率；X：照射光线波长；N.A.：物镜数值孔径分辨率以分辨两个点的最短距离表示，R值愈小，分辨能力愈大。物