细胞生物学实验指导

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1、细胞生物学实验技术实验医学研究中心编订2013-08实验一实验准备【目的】了解组织培养中实验器材的处理过程。【概述】目前多数的实验室还达不到用后即弃的条件，常要反复使用一些器皿，在组织细胞培养中器材的清洗、消毒灭菌仍是重要环节，是一项繁重而艰苦的工作,而且工作量很大,其主要目的是去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。【材料】1.玻璃器皿：培养瓶，血清瓶，试管，吸管2.塑料器皿：枪头，EP管【操作步骤】（一）玻璃器皿的处理玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洁干净，而且要带

2、适当电荷。苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。清洗玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，且不能残留任何毒性物质。为了保证清洗的质量，一般玻璃器皿的处理分为六个个步骤。1.浸泡：新的玻璃器皿首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。使用过的玻璃器皿用1‰的新洁尔灭或清水浸泡。泡时应将器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。2.刷洗：一般多用毛刷和洗涤剂或洗衣粉进行洗涤，以去除器皿内外表面的杂质。3.浸酸：酸就是清洁液，由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水桉一定比例配制而成,具有很强的氧化作用

3、，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可被完全清除。刷洗后的玻璃器皿需干燥后才能浸入酸中，浸泡的时间至少应浸泡过夜。配方成分常用方弱酸次强酸强酸重铬酸钾（g）1005010060清水(ml)80010001000200浓硫酸(ml)20090160800硫酸浓度(%)20814804.冲洗：玻璃器皿经浸酸后，必须彻底冲洗，否则对细胞生长不利。使用流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满、倒掉，须重复十次以上，然后，再用蒸馏水漂洗2～3次，最后用三蒸水漂洗一次。烤箱内烘干备用。5.包装：包装的

4、目的是防止消毒灭菌后再次受到污染，所以经清洗烤干的器材应严格包装后再进行消毒灭菌处理。6.消毒灭菌：包括干热消毒和湿热消毒。干热消毒一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿，需加温到160℃，保持90～120min方能杀死芽孢。湿热消毒是一种有效的消毒方法,一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。因物品不同，其有效灭菌压力和时间不同，一般物品（如布类、金属器械、玻璃器皿等）消毒的要求是101.33kpa（相当于15磅,121℃）20min，某些培养用液、橡胶制品、塑料器皿等要求为67.55kpa(相当于10磅,115℃)10min。（二）塑

5、料器皿的处理1.组织培养常用的塑料器皿包括各种培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要为进口的一次性物品，供应商提供给用户时已消毒灭菌并密封包装，打开包装即可使用。2.一些不是无菌包装的塑料器皿，只要包装高压灭菌消毒就可以使用了。实验二细胞传代【目的】学习细胞传代方法，扩增细胞。【概述】培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。【材料】（一）仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱、倒

6、置显微镜、培养箱（二）耗材：吸管、培养瓶、枪头、15ml离心管、EP管、（三）试剂：D-Hanks液、RPMI1640(含10%FBS)、消化液（胰蛋白酶/EDTA1：1）【操作步骤】（一）贴壁细胞的消化法传代：1.选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后连同培养液倒出，加入D-Hanks3ml，使液体覆盖在细胞生长面，轻轻晃动培养瓶，去液体。2.加入消化液1ml，使消化液浸没细胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现细胞质回缩，胞体变圆即可终止消化)3.加入3mlD-Hanks液，

7、轻轻吹打细胞生长面，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。4.将细胞悬液移至15ml离心管中，1000rpm*5min离心。5.去上清，加入新鲜的培养液2ml轻轻吹打成悬液。6.可计数，按需分别接种在新的培养瓶内。也可按1：2或1：3分配传代培养。（二）悬浮细胞的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。离心传代法：1.将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；2.离心1000rpm，5min；3.弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；4.计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即

8、让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。(三)、部分贴壁细胞的传代部分贴壁不牢的细胞，如293细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对